[發(fā)明專利]一種用于抑制豬瘟病毒復(fù)制的NS5B303shRNA及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410001384.9
• 申請日: 2012-06-04
• 公開（公告）號: CN103695431A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉湘濤;陳妍;田宏;吳錦艷;尚佑軍;尹雙輝;王光祥;靳野;張克山;楊順利;劉永杰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/10;A61P31/14
• 代理公司: 甘肅省知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)中心 62100
• 代理人: 鮮林

本申請是“申請日：2012年6月4日、申請?zhí)枺?01210180327.2、名稱：一種用于抑制豬瘟病毒復(fù)制的RNAi及其制備方法”的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抑制豬瘟病毒復(fù)制的方法，具體說是一種用于抑制豬瘟病毒復(fù)制的NS5B303shRNA（NS非結(jié)構(gòu)蛋白，shRNA?short?hairpin?RNA短發(fā)夾脫氧核糖核酸），本發(fā)明還包括NS5B303shRNA的制備方法。

背景技術(shù)

豬瘟(Classical?swine?fever,CSF)是世界范圍內(nèi)嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一。為了區(qū)別于非洲豬瘟，歐洲人稱其為“古典豬瘟(Classical?swine?fever,CSF)”。其病原是豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus,CSFV)。CSFV是RNA病毒，屬黃病毒科(Flaviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)的成員，與同屬的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine?viral?diarrhea?virus,BVDV)和綿羊邊界病病毒(Border?disease?virus,BDV)在抗原性和結(jié)構(gòu)上關(guān)系密切。CSFV是具有囊膜的正鏈RNA（核糖核酸）病毒，具有感染性。CSFV基因組共編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白、8種非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)占據(jù)病毒基因組5′端的1/3，非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)除Npro編碼序列位于基因組5′端外，其余均位于病毒基因組3′端的2/3。一般認為病毒侵染細胞是通過囊膜蛋白與細胞表面受體相互作用形成Infecosome（感染復(fù)合體）后進入宿主細胞。然而對CSFV感染細胞的細節(jié)尚不甚明了。而傳統(tǒng)的疫苗免疫等措施不能有效地應(yīng)對豬瘟的暴發(fā)和流行，RNAi（核糖核酸干擾）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其在抗病毒方面的研究進展，為豬瘟的防制研究開辟了一個新的探索領(lǐng)域。

RNA干擾(RNA?interference,RNAi)是通過內(nèi)、外源雙鏈RNA觸發(fā)的，由19-23bp小分子干擾RNA片段(siRNA)誘導(dǎo)的同源性mRNA（信使RNA）的降解，從而使該基因表達沉默(gene?silence)的過程。它是廣泛存在于動、植物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，是生物體在進化過程中，抵御病毒感染及因重復(fù)序列和突變引起的基因組不穩(wěn)定性的保護機制，同時也是一種真核生物體內(nèi)的基因調(diào)控機制。分子生物學(xué)研究的早期，人們對基因的了解都是通過基因突變而獲得的。近年來，反向遺傳學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能的研究，使人們對基因功能的研究取得了飛躍式的發(fā)展，但該技術(shù)在基因重組方面耗時費力。在如今的后基因組時代，RNAi技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢成為分析基因功能的又一種方法，得到了廣泛的認同。近年來，許多學(xué)者以人工誘導(dǎo)RNAi的方式進行了病毒復(fù)制的干擾研究，取得了良好進展。例如在抗乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、艾滋病毒（HIV）和脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）等病毒病的研究中都發(fā)現(xiàn)RNA干擾，對于抑制這類病毒的復(fù)制效果極好，可能為這類病毒病的治療創(chuàng)立新的、更有效的途徑。但是目前關(guān)于RNAi仍有很多問題亟待解決，例如：進行RNAi的時間和靶位點；哺乳類動物中的干擾素反應(yīng)；RNAi作用的確切機制；脫靶效應(yīng)等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用機制的探討上，以及如何改進運用RNAi的方法來研究基因的功能。本發(fā)明注重干擾靶區(qū)的選擇和shRNA的初步篩選，在細胞水平上考察了所選shRNA對靶基因的干擾作用，并借助慢病毒表達系統(tǒng)，篩選表達shRNA的陽性PK-15細胞克隆，在細胞模型水平有助于闡明抑制FMDV復(fù)制的關(guān)鍵靶基因、病原感染過程及病原中該靶基因的生物學(xué)功能，并為轉(zhuǎn)基因抗病育種打下堅實基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)難以控制豬瘟的不足，構(gòu)建靶向豬瘟病毒基因組的特定保守基因區(qū)段的慢病毒載體介導(dǎo)穩(wěn)定整合的RNA干擾技術(shù)，本發(fā)明還提供該技術(shù)的制備方法。

為解決上述問題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案：

一種用于抑制豬瘟病毒復(fù)制的NS5B303shRNA，包含siRNA序列，通過構(gòu)建NS5B303shRNA(short?hairpin?RNA即短發(fā)夾脫氧核糖核酸)慢病毒表達載體，獲得復(fù)制缺陷型慢病毒，用獲得的慢病毒感染PK-15細胞，篩選出具有抑制豬瘟病毒復(fù)制的PK-15細胞克隆。

所述序列SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2即：

NS5B303:5’→3’

SEQ?ID?NO:1：T?CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA

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