[發(fā)明專利]一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410001384.9
• 申請日: 2012-06-04
• 公開（公告）號: CN103695431A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉湘濤;陳妍;田宏;吳錦艷;尚佑軍;尹雙輝;王光祥;靳野;張克山;楊順利;劉永杰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/10;A61P31/14
• 代理公司: 甘肅省知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)中心 62100
• 代理人: 鮮林

1.一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，其特征在于包含siRNA序列、通過構(gòu)建NS5B303shRNA慢病毒表達載體，獲得復制缺陷型慢病毒，用所述慢病毒感染PK-15細胞，篩選表達NS5B303shRNA的PK-15細胞克隆并驗證其對CSFV的抑制效果；

所述具有抑制效果的NS5B303shRNA序列SEQ?ID?NO:1和?SEQ?ID?NO:2，即：

NS5B303:?5’→3’?

SEQ?ID?NO:1：T?CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC

SEQ?ID?NO:2：B?AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCG

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC

。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，其特征在于所述NS5B303shRNA表達載體的構(gòu)建，包括NS5B303shRNA?克隆載體的構(gòu)建和表達載體的構(gòu)建。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，其特征在于所述完整假病毒的獲得是將NS5B303shRNA表達質(zhì)粒與Packaging?Mix共同轉(zhuǎn)染293-FT細胞，收獲細胞上清，獲得具有感染性的慢病毒。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，其特征在于所述用收獲復制缺陷型慢病毒感染PK-15細胞，采用滅瘟素blasticidin抗性篩選，獲得表達NS5B303shRNA的PK-15陽性細胞克隆。

5.一種如權(quán)利要求1所述NS5B303shRNA的制備方法，包括以下步驟：?

a.?設(shè)計并合成NS5B303shRNA對應(yīng)的DNA序列—ds?oligo；

b.?利用T4?DNA連接酶將ds?oligo?克隆進pEN/U6?載體；

c.?轉(zhuǎn)化TOP?10感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆，測序檢驗序列的保真性；

d.?將上述pEN/U6-NS5B303質(zhì)粒與pDEST載體進行LR重組，獲得表達骨架；

e.?獲得的表達骨架與Packaging?Mix共轉(zhuǎn)染293-FT?細胞，產(chǎn)生復制缺陷型慢病毒粒子；

f．將產(chǎn)生的復制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15細胞；

g.?blasticidin抗性篩選，獲得表達NS5B303shRNA的PK-15細胞陽性克隆；

h．分別用Real-time?RT-PCR、間接免疫熒光及流式細胞術(shù)驗證抑制效果。