[發(fā)明專利]一種鯉鈣蛋白酶抑制蛋白基因克隆及其表達(dá)量檢測(cè)的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410000114.6
• 申請(qǐng)日: 2014-01-02
• 公開（公告）號(hào): CN103937807A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳偉興;黃金善;管雪婷;苗曉微
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/15
• 分類號(hào): C12N15/15;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因表達(dá)量檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種鯉鈣蛋白酶抑制蛋白基因克隆及其表達(dá)量檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)

在全世界范圍內(nèi)，經(jīng)濟(jì)魚類多達(dá)幾千種，種類不同，其肌肉有不同的風(fēng)味或肉質(zhì)。不同品種之間的遺傳差異，導(dǎo)致肌纖維類型的不同，Staun證實(shí)肌纖維直徑和肌纖維密度等性狀主要由遺傳因素所決定，遺傳力較高。在肌肉組織中鈣蛋白酶系統(tǒng)控制著肌纖維蛋白的降解，是肌肉蛋白質(zhì)降解的限速步驟，因此鈣蛋白酶系統(tǒng)在肉的嫩化中起著重要作用。鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)是細(xì)胞內(nèi)專一抑制鈣蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。用不同的方法對(duì)牛CAST基因進(jìn)行SNPs掃描，獲得一些不同的多態(tài)性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)CAST基因的多態(tài)性與牛的嫩度顯著相關(guān)。有研究者對(duì)豬CAST、CAPN1和CAPN3基因的多態(tài)性及屠宰后肌肉中鈣蛋白酶活性表達(dá)與肉質(zhì)的相關(guān)性，結(jié)果表明：CAST基因?qū)︹}蛋白酶的活化時(shí)間和滴水損失有影響。由此可見，CAST與肉質(zhì)，尤其是嫩度有很大的相關(guān)性，可以作為肉質(zhì)性狀評(píng)定及改良的候選基因。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鯉鈣蛋白酶抑制蛋白基因克隆及其表達(dá)量檢測(cè)的方法，旨在解決影響鯉肌肉嫩度相關(guān)候選CAST基因的克隆及其相對(duì)表達(dá)量的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種鯉鈣蛋白酶抑制蛋白基因的克隆方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)多組引物，分別為：

CAST1-F：5’-TCAACACCTGCATCTTCTGC-3’；

CAST1-R：5’-TTGAGCTGGAGACACAAACG-3’；

CAST2-F：5’-CGGATACAGAAAGGAAGACCTG-3’；

CAST2-R：5’-AGTATGTCCATCGCATCATCTG-3’；

CAST3-F：5’-GAACACAGATGATGCGATGG-3’；

CAST3-R：5’-TGATCTGGTGGAAGGGAGTC-3’；

CAST3R1：5’-GTTTGTCCTGCCTCTAAGTCT-3’；

CAST3R2：5’-TTCAGTCTGCCGTCTCTGGCCCCC-3’；

CAST5R1：5’-GGTTGTGATGATGGTAAAGTGC-3’；

CAST5R2：5’-CCTTATCTTTCAGAGGGTCCGT-3’；

所述CAST1-F、CAST1-R、CAST2-F、CAST2-R、CAST3-F和CAST3-R為克隆CAST基因部分編碼序列用引物，所述CAST3R1、CAST3R2、CAST5R1以及CAST5R2為克隆CAST基因5’、3’UTR用引物；

(2)以目標(biāo)生物的RNA為模板，在RT-PCR過程中加入步驟(1)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR、電泳，確定CAST基因部分編碼序列、CAST基因5’UTR序列以及CAST基因3’UTR序列，并確定目標(biāo)生物CAST基因完整序列。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種鯉鈣蛋白酶抑制蛋白基因表達(dá)量的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

根據(jù)所述CAST基因完整序列，設(shè)計(jì)引物：

CASTY-F：5’-CATCTGTTTGTCCTGCCTCTAAG-3’；

CASTY-R：5’-GATGAGGAACCTTCTGACAACTG-3’；其中，所述CASTY-F以及CASTY-R為CAST基因表達(dá)定量用引物；以目標(biāo)生物的RNA為模板，在RT-PCR過程中加入引物CASTY-F、引物CASTY-R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR、電泳，確定目標(biāo)生物各組織中鯉鈣蛋白酶抑制蛋白基因基因表達(dá)情況。