[發明專利]生物樣品中進行生物發光共振能量轉移(BRET)分析的方式和方法

有效

• 申請號: 201380079698.4
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN105555964B
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: K·P·約翰森;A·思琪納;R·格里斯
• 申請（專利權）人: 洛桑聯邦理工學院
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;G01N33/542
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶啟長;陶家蓉

本發明涉及使用發光進行體外檢測方法的領域。本發明提供用于使用生物發光共振能量轉移(BRET)檢測樣品中感興趣的分析物的傳感器分子，所述傳感器分子包括系連至合成的調節分子的蛋白質部分。本發明還提供包含傳感器的分析裝置和使用所述傳感器分子的方法。

本發明涉及使用發光進行體外檢測方法的領域。發光是能量特異引導至分子以產生激發態的現象。回到低能量狀態伴隨著光子的釋放。發光包括熒光、磷光、化學發光和生物發光。發光可用于分析游離分析物或生物相互作用。

2009年，發明人提出了生成針對小分子分析物的半合成蛋白質基的生物傳感器的方法。熒光生物傳感器稱為SNap-標簽指示蛋白，具有熒光分子內系連(Snifit)。參見Brun等J Am Chem Soc.2009；131(16):5873-84和Brun等J Am Chem Soc.2011；133(40):16235-42。

重要的是，Snifit是比率型(ratiometric)傳感器，由單分子組成，其允許獨立于實際傳感器濃度而形成傳感器讀數。Snifit傳感器由SNAP-標簽、熒光蛋白和代謝物-結合蛋白組成。SNAP-標簽用合成分子特異標記，所述分子含有代謝物-結合蛋白的配體和熒光團。在標記的傳感器中，感興趣的代謝物從所述結合蛋白中置換分子內配體，從而將傳感器蛋白從封閉構型變為開放構型。讀數是熒光蛋白和系連的熒光團的熒光強度中的伴隨比率型變化。因此，分析物的存在與否導致傳感器蛋白中的構型改變，從而兩個熒光團相對彼此的位置改變，并且因此它們(讀數)之間的FRET的效率也發生變化。通過選擇合適的結合蛋白和其相關可系連配體，事實上任何小代謝物均可被檢測，并且公開了數個示例。參見Brun等J Am Chem Soc.2012；134(18):7676-8和Masharina等J Am Chem Soc.2012；134(46):19026-34。

然而，當前已知的Snifit-方法至少受下述缺陷的限制：(i)比率變化較小并且目前沒人能確定通過提高閉合狀態中的RET效率來提高比率變化的方法；(ii)將比率型RET傳感器直接用于定量吸收傳感器的發射波長處光的復合樣品(例如血清或其他體液)中的分析物易于出現假象，得到不可靠的分析結果。

為了確定通過使用傳統Snifit提高閉合傳感器中的RET效率來進一步改善比率變化的策略的大量嘗試均告失敗(JACS,2011(133,16235–16242)。此外，復合樣品可包含各種濃度的熒光分子，這會干擾定量。比率型讀數還會受到樣品(例如血清或其他體液)光吸收的影響，從而使定量易于出現誤差。

而理論上，基于作為內光源的熒光素酶的傳感器(即BRET)會降低熒光背景問題并可能提高靈敏度，當前尚未提出適用于光吸收樣品中分析物的混合-和-測量定量的比率型BRET基的傳感器。

盡管生物發光技術的(醫藥)應用中有大發展，但當前沒有可用的BRET基、便攜、混合-和-測量傳感器用于分析物的精確床邊(point-of-care)定量(例如用于監控治療藥物)的事實表明產生此類傳感器所面臨的技術難度。

因此發明人提供比率型發光傳感器及其使用方法，所述傳感器包括由比率變化得到改善的單分子或由其組成，其克服了至少部分上述缺陷。具體地，其旨在結構優化產生較高的信號改變，并使傳感器可用于直接定量分析物，例如體液或其他復合物、光吸收樣品中的藥物、代謝物或蛋白質。優選地，檢測應與便攜相機或智能手機兼容。