[發(fā)明專(zhuān)利]用于生物分子檢測(cè)的催化性核酸和金納米粒子

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380078689.3
• 申請(qǐng)日: 2013-06-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105431547A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沃倫·切·沃·陳;基里洛·扎戈洛夫斯基
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 多倫多大學(xué)理事會(huì)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C07H21/00;C40B30/04
• 代理公司: 廣州粵高專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi);鄭永泉

技術(shù)領(lǐng)域

本公開(kāi)涉及生物分子檢測(cè)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及使用催化性核酸分子和金納米粒子檢測(cè)樣品中靶（target）生物分子的方法。

背景技術(shù)

簡(jiǎn)單的、具有成本效益的、靈敏的和特異的照護(hù)現(xiàn)場(chǎng)（point-of-care，POC）診斷學(xué)的開(kāi)發(fā)代表了21世紀(jì)的重大挑戰(zhàn)。[1]感染性疾病的傳播造成了全球經(jīng)濟(jì)和生活的巨大損失。控制疾病的傳播的方法是早期在POC檢測(cè)病原體，以及施行適當(dāng)?shù)闹委熁蚋綦x。[2]作為生物標(biāo)記物的DNA的檢測(cè)是目前廣泛使用的病原檢測(cè)的技術(shù)。[3]實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(qPCR)是精選的方法，因?yàn)樗感盘?hào)擴(kuò)增（amplification）步驟以實(shí)現(xiàn)遺傳靶標(biāo)（genetictarget）的高度靈敏和特異性檢測(cè)。[4]然而，qPCR需要昂貴的設(shè)備和受過(guò)高級(jí)訓(xùn)練的人員，限制了對(duì)于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)使用。強(qiáng)烈需要開(kāi)發(fā)更便宜且更簡(jiǎn)單的用于檢測(cè)DNA靶標(biāo)和/或其它生物靶標(biāo)的方法[5]。

DNA酶（DNAzyme）是一種合成的DNA酶（DNAenzyme），其能夠催化另一種核酸分子的裂解（cheavage）。[6-8]由于利用了多個(gè)代謝回轉(zhuǎn)（turnover）來(lái)進(jìn)行催化，所以DNA酶將酶擴(kuò)增步驟引入到實(shí)驗(yàn)設(shè)置中。[9]該擴(kuò)增不需要昂貴的且具有低熱和儲(chǔ)存穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)成分而進(jìn)行。雖然最初設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)Pb²⁺和其它二價(jià)陽(yáng)離子，[10-19]但已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了允許DNA酶檢測(cè)生物分子靶標(biāo)的若干修改。[9,20-27]使用兩種主要的方法來(lái)實(shí)施遺傳靶標(biāo)的檢測(cè)。第一種方法利用類(lèi)過(guò)氧化物酶的DNA酶（peroxidase-mimickingDNAzyme）的競(jìng)爭(zhēng)性活化，該類(lèi)過(guò)氧化物酶的DNA酶能夠促進(jìn)比色或化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的產(chǎn)生。[28]在第二種更靈敏的方法中，多個(gè)團(tuán)隊(duì)遵循相似的策略通過(guò)將DNA酶分裂成無(wú)活性的成分以實(shí)施遺傳靶標(biāo)的檢測(cè)，該無(wú)活性的成分能夠通過(guò)靶標(biāo)結(jié)合而再活化。[9,23-25,29]然而，這些研究利用熒光作為讀數(shù)（readout），該讀數(shù)對(duì)于POC應(yīng)用不是最佳的檢測(cè)模式，因?yàn)樗枰褂孟喈?dāng)復(fù)雜的熒光計(jì)裝置。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了一種可供選擇的利用金納米粒子（GNP）的比色讀數(shù)的方法用于金屬離子、腺苷和可卡因的檢測(cè)。[10-14,16-18,20,21]GNP吸收光的波長(zhǎng)取決于它們是處于單分散還是聚集狀態(tài)。[30]由于處于單分散或聚集狀態(tài)的GNP溶液以它們各自的紅色或紫色是容易辨識(shí)的，所以這種方法提供了能夠肉眼可視的清楚的比色結(jié)果。[31]

照此，發(fā)明的目的是通過(guò)將DNA酶技術(shù)與GNP結(jié)合以策劃能夠用于遠(yuǎn)程設(shè)置的簡(jiǎn)單的照護(hù)現(xiàn)場(chǎng)診斷平臺(tái)，以克服上述限制[32,33]。

發(fā)明的進(jìn)一步和其它目的將會(huì)從下面的發(fā)明內(nèi)容、發(fā)明討論及其實(shí)施方案和實(shí)施例得以了解。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及擴(kuò)增金納米粒子的表面等離子體與DNA酶信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合的比色偶合（coupling），以策劃具有簡(jiǎn)單的比色讀數(shù)的用于遺傳靶標(biāo)的快速且簡(jiǎn)單的檢測(cè)平臺(tái)。本公開(kāi)的創(chuàng)造性包括這兩種用于生物靶標(biāo)的檢測(cè)的新興技術(shù)的融合，其可以用于感染性疾病靶標(biāo)的照護(hù)現(xiàn)場(chǎng)分析。

照此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)樣品中生物靶標(biāo)的存在的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括：(a)將所述樣品與下列項(xiàng)接觸：(i)未催化的核酸底物（substrate），(ii)催化性核酸，所述催化性核酸經(jīng)配置以在所述靶標(biāo)的存在下單獨(dú)地催化所述底物，及(iii)GNP，所述GNP用連接部分官能化，以與所述未催化的核酸底物組裝；以及(b)分析所述樣品以確定所述GNP是處于實(shí)質(zhì)上分散的形式還是處于與所述未催化的核酸底物組裝的形式，其中所述GNP處于實(shí)質(zhì)上分散的形式表明所述靶標(biāo)存在于所述樣品中。

在用于檢測(cè)樣品中生物靶標(biāo)的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在合適的溫度下在足量時(shí)間內(nèi)首先將(i)和(ii)添加到所述樣品中，然后將(iii)添加到所述樣品中。

在用于檢測(cè)樣品中生物靶標(biāo)的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述催化性核酸以預(yù)催化性核酸亞單位形式提供，每個(gè)預(yù)催化性核酸亞單位包括經(jīng)配置以結(jié)合到所述靶標(biāo)的至少部分上的傳感器域（sensordomain），及當(dāng)所述靶標(biāo)結(jié)合到所述傳感器域上時(shí)單獨(dú)地催化所述未催化的核酸底物的催化域（catalyticdomain）。

在用于檢測(cè)樣品中生物靶標(biāo)的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述GNP用核酸鏈官能化，該核酸鏈與用于組裝的所述未催化的核酸底物的3'末端和5'末端雜交。