[發(fā)明專利]肽片段的制備方法及該方法中使用的肽片段制備用試劑盒、以及分析方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380078545.8
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN105518447B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 島田崇史;深尾典子;青木智景;佐藤孝明
• 申請（專利權(quán)）人: 株式會社島津制作所
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N1/28
• 代理公司: 北京林達(dá)劉知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11277
• 代理人: 劉新宇,李茂家

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使用蛋白酶位置選擇性地切斷抗體等蛋白質(zhì)從而制備肽片段的方法、及該方法中使用的肽片段制備用試劑盒。進(jìn)而，本發(fā)明涉及對利用該方法制備的肽片段利用質(zhì)譜法等進(jìn)行分析從而進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測、定量的分析方法。

背景技術(shù)

抗體藥物的需求正迅速擴(kuò)大，在臨床現(xiàn)場，對血液中的抗體濃度進(jìn)行簡便地定量的重要性在提高。一直以來，雖然并未重視正確測定給與抗體藥物后的血藥濃度，但伴隨曲妥珠單抗(商品名：Herceptin)在胃癌應(yīng)用擴(kuò)大的臨床試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其血藥濃度與生存期之間存在顯著性差異之后，在抗體藥物的臨床試驗(yàn)等中，測定抗體的血藥濃度也正成為必須的。例如，在確認(rèn)藥代動力學(xué)等質(zhì)量管理、確認(rèn)仿制藥在臨床試驗(yàn)等中與原藥的等效性等方面也要求進(jìn)行抗體藥物的鑒定、其血藥濃度的定量。

使用了抗原抗體反應(yīng)的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay))法的特異性和定量性優(yōu)異，所以在臨床試驗(yàn)等中廣泛用于血液中的抗原、抗體的檢測/定量等。然而，ELISA法是以單一的蛋白質(zhì)(抗原或抗體)的檢測為目的的方法，不能同時檢測多種不同的蛋白質(zhì)。為了利用ELISA法檢測多種蛋白質(zhì)，需要針對每一個檢測對象制作特異性抗體并設(shè)定濃度測定條件，需要巨大的精力和費(fèi)用。另外，由于ELISA法利用抗原抗體反應(yīng)，所以已知下述問題：聯(lián)合用藥、與代謝物的交叉反應(yīng)可能影響測定結(jié)果，一部分的抗體藥物難以用于保存被檢體等。

因此，期待開發(fā)出能夠普遍適用于各種抗體的分析方法。伴隨蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，開發(fā)了利用質(zhì)譜法可對蛋白質(zhì)網(wǎng)羅性地檢測/定量的技術(shù)，近年來，也可進(jìn)行抗體等巨大生物體分子的解析。對于質(zhì)譜，需要對測定對象分子進(jìn) 行離子化，通常難以直接用質(zhì)譜對抗體等巨大生物體分子進(jìn)行分析。因此，采用了如下方法：利用蛋白酶消化來切斷蛋白質(zhì)(片段化)，從經(jīng)片段化的肽中選擇針對分析對象的蛋白質(zhì)具有特異性的氨基酸序列的肽片段，利用質(zhì)譜裝置進(jìn)行檢測/定量的方法。通常，為了提高利用蛋白酶的消化效率，在使基質(zhì)蛋白在高濃度的尿素、胍溶液中變性之后，進(jìn)行蛋白酶消化。

在利用蛋白酶消化對抗體等蛋白質(zhì)進(jìn)行片段化并進(jìn)行質(zhì)量分析時，選擇性地檢測出作為檢測對象的肽片段是很重要的。然而，有時會難以從含有多種多樣的夾雜物的生物體試樣中檢測出源自分析對象的蛋白質(zhì)的特定肽片段。即，由于血液等生物體試樣含有多種多樣的夾雜物，所以在生物體試樣中添加蛋白酶時，源自夾雜物的蛋白質(zhì)也會被蛋白酶消化，從而生成數(shù)量龐大的肽片段。為了從中選擇性地檢測/定量源自檢測對象(例如特定的抗體)的目標(biāo)肽片段，在供于質(zhì)譜之前，需要對肽片段進(jìn)行分離、濃縮等操作。另外，如果由檢測對象之外的蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有與檢測對象的蛋白質(zhì)的肽片段相同的氨基酸序列的肽片段，則會成為誤檢、定量性降低的原因。因此，存在伴隨由生物體試樣產(chǎn)生的肽片段數(shù)的增加而作為檢測對象的肽片段的選擇變得更加困難的傾向。

鑒于這樣的生物體試樣的復(fù)雜性，開發(fā)出了如下的方法：在利用液相色譜(LC)純化試樣之后，供于質(zhì)譜裝置的方法；通過利用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)等產(chǎn)生離子斷裂的多級的質(zhì)譜、或它們的組合(多反應(yīng)監(jiān)測，MRM)，從而對生物體試樣等復(fù)雜試樣中的特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的方法。然而，存在如下問題：試樣變得越復(fù)雜，越需要組合各種各樣的分離模式、越需要高精度的實(shí)驗(yàn)裝置，或分析條件的設(shè)定越需要花費(fèi)大量的時間。

另外，即使在使用了純化后的試樣的情況下，抗體等大蛋白也因蛋白酶消化而產(chǎn)生多種肽片段，因此，存在從中選擇性地檢測/定量針對檢測對象具有特有的氨基酸序列的肽片段變得困難的傾向。鑒于這樣的問題，開發(fā)出了：針對分析對象的蛋白質(zhì)進(jìn)行位置選擇性地蛋白酶消化，使試樣中的肽片段的數(shù)量(種類)減少，提高分析精度且簡化分析的方法。例如，專利文獻(xiàn)1中提出 了如下方法：在利用抗體的胃蛋白酶消化產(chǎn)生F(ab’)₂片段之后，進(jìn)而用胰蛋白酶等蛋白酶消化F(ab’)₂片段，產(chǎn)生含有抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的肽片段，利用質(zhì)譜對含有CDR的肽片段進(jìn)行檢測/定量。

在此對抗體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行說明。所有的抗體具有2條重鏈(H鏈)和2條輕鏈(L鏈)。1條輕鏈和1條重鏈通過二硫鍵連接而形成異二聚體，進(jìn)而2個異二聚體通過2個二硫(S-S)鍵連接而形成“Y”字型的異四聚體(參照圖2)。抗體具有由重鏈形成的1個Fc(Fragment,crystallizable)結(jié)構(gòu)域和由重鏈和輕鏈形成的2個Fab(Fragment,antigen binding)結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域和Fab結(jié)構(gòu)域借助鉸鏈部連接。