[發(fā)明專利]利用酪氨酸酶制備的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)、其制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380077815.3
• 申請(qǐng)日: 2013-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN105555776A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金秉祺;李相赫;白基憲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)
• 主分類號(hào): C07D311/32
• 分類號(hào): C07D311/32;A61K31/353;C12P7/22;A61P35/00
• 代理公司: 北京三友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11127
• 代理人: 龐東成;褚瑤楊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用具有廣的基質(zhì)特異性的酪氨酸酶(tyrosianse)以高的生產(chǎn)率和 收率篩選性地從多種單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)(monophenoliccompounds)僅生成兒茶酚型 結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法。由此，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)利用酶反應(yīng)的功能性兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的 批量生產(chǎn)，且可適用于原料化及醫(yī)療用產(chǎn)品生產(chǎn)。

背景技術(shù)

據(jù)報(bào)告，很多兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)(catecholderivatives)在抗氧化、抗癌、抗炎 癥或抗病毒等效果中呈現(xiàn)好的生理活性，與單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)(monophenolic compounds)相比，其效果更高。尤其，兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)作為酪氨酸酶(tyrosinase) 的抑制劑利用，并具有減少基于酪氨酸酶的黑色素(melanin)的生產(chǎn)的效果。并且， 眾所周知，在大豆甙元(daidzein，來源于大豆的異黃酮)中，特異性地實(shí)現(xiàn)鄰羥基 化(ortho-hydroxylation)的3’-鄰羥基大豆甙元(3’-ODI，3’-orthohydorxydaidzein)的 一部分存在于熟成的大醬中，預(yù)防由紫外線引起的皮膚癌，并抑制與癌轉(zhuǎn)移相關(guān) 的活性(JBC，2010，vol.285，pp.21458；JBC，2011，vol.286，pp.14246)。作為 來源于芹菜素(apigenin)的兒茶酚型物質(zhì)，羥基化的木犀草素(luteolin)在抗氧化性 好的洋薊(arichoke)中可提取極少量，據(jù)最新報(bào)告，可在乳腺癌治療中使用(Food Chemistry，2013，"Luteolinsensitisesdrug-resistanthumanbreastcancercellsto tamoxifenviatheinhibitionofcyclinE2expression")。除此之外，眾所周知，橄欖 油中的羥基酪醇(hydroxytyrosol)、葡萄酒中的白皮杉醇(piceatannol)等的兒茶酚型 物質(zhì)還用作強(qiáng)力的抗氧化劑。高分子物質(zhì)上的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)可摹仿貽貝蛋白 質(zhì)的功能，其應(yīng)用領(lǐng)域從醫(yī)療物質(zhì)至表面改性納米工程正廣泛地進(jìn)行研究(Annu RevMaterRes.2011141：99-132Biofouling2012，28：8，865-877)。

在利用以往的生物催化劑來生產(chǎn)兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)的情況下，利用包括P450 酶在內(nèi)的多種單加氧酶(mono-oxigenase)。但是，在大部分的單加氧酶的情況下， 需要輔酶，并需要用于電子傳遞的雙還原酶(reductase)。這會(huì)影響基質(zhì)的生物轉(zhuǎn) 化反應(yīng)速度，并由低的收率和生產(chǎn)率引起。相反，酪氨酸酶的單酚結(jié)構(gòu)物質(zhì)氧化 反應(yīng)相對(duì)快(作為參考，來源于蘑菇類的酪氨酸酶的kcat/Km值為大致 1000mM^-1s-¹)，不伴隨用于輔酶的電子傳遞反應(yīng)的雙酶。

但是，酪氨酸酶的問題如下：使單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)羥基化，來在生產(chǎn)兒茶酚型 結(jié)構(gòu)物質(zhì)的第一次羥基化反應(yīng)(monophenolaseactivity)之后，在單酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)中 生物轉(zhuǎn)化的兒茶酚型結(jié)構(gòu)物質(zhì)借助酪氨酸酶的第二次氧化反應(yīng)(dipehnolase activity)生物轉(zhuǎn)化為醌型物質(zhì)(quinoniccompounds)。通常，醌型物質(zhì)形成自由基 (radical)來快速形成黑色素(melanin)，生成的黑色素以穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)體具有阻隔紫外 線區(qū)域的光的功能。

酪氨酸酶由活性部位周邊6個(gè)組氨酸(Histidine)固定兩個(gè)銅離子，上述兩個(gè) 銅離子之間的距離在包括銅的兒茶酚氧化酶(catecholoxidase)和其他酪氨酸酶組 中規(guī)定地保持。根據(jù)氧的存在與否，并根據(jù)在兩個(gè)銅之間結(jié)合的氧原子的數(shù)量， 酪氨酸酶區(qū)分為三種形態(tài)，即，脫氧形態(tài)(脫氧-酪氨酸酶(deoxy-tyrosinase))、氧 形態(tài)(氧-酪氨酸酶(oxy-tyrosinase))及甲硫氨酸形態(tài)(甲硫氨酸-酪氨酸酶 (met-tyrosinase))。

脫氧形態(tài)(脫氧-酪氨酸酶(deoxy-tyrosinase))為兩個(gè)銅離子之間不包含氧的形 態(tài)，若不供給氧，則成為無法進(jìn)行羥基化及氧化反應(yīng)的非活性體。

若在空氣中，氧在溶劑中解離或供給過氧化氫，則在脫氧形態(tài)的兩個(gè)銅離子 之間固定一個(gè)氧(O₂)分子，并將這種形態(tài)稱為氧形態(tài)(氧-酪氨酸酶 (oxy-tyrosinase))。在這種氧形態(tài)中，若單酚的氧原子與一個(gè)銅離子相結(jié)合，則開 始酪氨酸酶的第一次羥基化反應(yīng)。