[發(fā)明專利]多次甲基化合物和其作為熒光標(biāo)記物的用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380076098.2
• 申請(qǐng)日: 2013-03-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105164106B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尼古拉·尼古拉耶維奇·羅曼諾夫;曉海·劉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 伊魯米納劍橋有限公司
• 主分類號(hào): C07D209/08
• 分類號(hào): C07D209/08;C09B23/02;G01N33/00
• 代理公司: 北京安信方達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11262
• 代理人: 李平,鄭霞

技術(shù)領(lǐng)域

本公開(kāi)內(nèi)容涉及新的多次甲基化合物和其作為熒光標(biāo)記物的用途。特別地，化合物可以在核酸測(cè)序應(yīng)用中被用作用于核苷酸的熒光標(biāo)記物。

背景技術(shù)

在本申請(qǐng)中引用若干出版物和專利文獻(xiàn)，以便更充分地描述本公開(kāi)內(nèi)容所屬的領(lǐng)域的狀態(tài)。這些出版物和文獻(xiàn)中的每個(gè)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

利用熒光標(biāo)記物的核酸的非放射性檢測(cè)在分子生物學(xué)中是重要的技術(shù)。在重組DNA技術(shù)中采用的許多程序之前主要依賴于用例如³²P放射性地標(biāo)記的核苷酸或多核苷酸的使用。放射性化合物允許靈敏檢測(cè)核酸和其他感興趣的分子。然而，在放射性同位素的使用中存在嚴(yán)重的限制，諸如其費(fèi)用、有限的儲(chǔ)存期以及更重要地安全考慮。排除對(duì)放射性標(biāo)記物的需求提高安全性，同時(shí)減少與例如試劑處置相關(guān)的環(huán)境影響和成本。通過(guò)非限制性實(shí)例的方式，適合于非放射性熒光檢測(cè)的方法包括自動(dòng)DNA測(cè)序、雜交法、聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)和免疫測(cè)定。

對(duì)于許多應(yīng)用，期望采用多重光譜可區(qū)別的熒光標(biāo)記物以便實(shí)現(xiàn)多個(gè)空間上重疊的分析物的獨(dú)立檢測(cè)。在這類多重方法中，反應(yīng)容器的數(shù)目可以減少，從而簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)方案并且有利于產(chǎn)生應(yīng)用特定的試劑盒。例如，在多色自動(dòng)DNA測(cè)序中，多重?zé)晒鈾z測(cè)允許在單個(gè)電泳泳道中分析多個(gè)核苷酸堿基，從而使總處理能力(throughput)增加超過(guò)單色方法并且降低與泳道之間的電泳遷移率變化相關(guān)的不確定性。

然而，多重?zé)晒鈾z測(cè)可以是有問(wèn)題的并且有限制熒光標(biāo)記物的選擇的許多重要因素。首先，可能難以發(fā)現(xiàn)發(fā)射光譜在給定的應(yīng)用中被適當(dāng)?shù)毓庾V地分辨的染料化合物。此外，當(dāng)若干熒光染料被一起使用時(shí)，通過(guò)同時(shí)激發(fā)在可區(qū)別的光譜區(qū)中產(chǎn)生熒光信號(hào)可能是困難的，因?yàn)閷?duì)此可以是可用的染料的吸收帶通常被寬泛地分開(kāi)，所以難以實(shí)現(xiàn)幾乎相等的熒光激發(fā)效率(甚至對(duì)于兩種染料)。許多激發(fā)方法使用高功率光源，如激光并且因此染料必須具有足夠的光穩(wěn)定性以經(jīng)受這種激發(fā)。分子生物學(xué)方法中特別重要的最終考慮是熒光染料必須與使用的試劑化學(xué)成分諸如例如DNA合成溶劑和試劑、緩沖液、聚合酶和連接酶相容的程度。

隨著測(cè)序技術(shù)提高，需要開(kāi)發(fā)另外的熒光染料化合物、其核酸綴合物以及滿足以上限制中的全部并且特別適合于高總處理能力的分子方法諸如固相測(cè)序以及類似方法的染料組。

具有改進(jìn)的熒光性質(zhì)諸如熒光帶的熒光強(qiáng)度、形狀和最大波長(zhǎng)的熒光染料分子可以改進(jìn)核酸測(cè)序的速度和精確度。當(dāng)在基于水的生物緩沖液中并且在較高溫度下進(jìn)行測(cè)量時(shí)，強(qiáng)熒光信號(hào)是特別重要的，因?yàn)榇蟛糠秩玖系臒晒鈴?qiáng)度在這類條件下是顯著較低的。此外，染料被附接到其的堿基的性質(zhì)也影響最大熒光、熒光強(qiáng)度和其他光譜染料性質(zhì)。核堿基(mucleobase)和熒光染料之間的序列特定的相互作用可以通過(guò)熒光染料的特定設(shè)計(jì)來(lái)調(diào)整。熒光染料的結(jié)構(gòu)的優(yōu)化可以改進(jìn)核苷酸并入的效率、降低測(cè)序誤差的水平并且減少核酸測(cè)序中試劑的使用，并且因此降低核酸測(cè)序的成本。

發(fā)明內(nèi)容

本文描述改進(jìn)的多次甲基構(gòu)建體和其作為生物分子標(biāo)記物、特別地作為用于在核酸測(cè)序中使用的核苷酸的標(biāo)記物的用途。可以看到在使用新的熒光構(gòu)建體可獲得的標(biāo)記的核苷酸并入的效率和測(cè)序讀數(shù)的長(zhǎng)度上的具體改進(jìn)。

根據(jù)第一方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供式(I)的多次甲基染料化合物或其內(nèi)消旋形式：

其中mCat⁺或mAn^-是有機(jī)或無(wú)機(jī)的帶正電荷/帶負(fù)電荷的反離子，并且

m是整數(shù)0-3；

Ra₁和Ra₂中的每個(gè)獨(dú)立地是H、SO₃^-、磺酰胺、鹵素、或稠合至相鄰碳原子的另外的環(huán)；

Rb是任選地被取代的芳基或任選地被取代的烷基；

Rc₁和Rc₂中的每個(gè)獨(dú)立地是烷基或被取代的烷基；并且

Rb、或Rc₁或Rc₂中的一個(gè)包含用于進(jìn)一步附接至另外的分子的連接部分或被連接至另外的分子。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的化合物可以與多種底物部分諸如例如核苷、核苷酸、多核苷酸、多肽、碳水化合物、配體、顆粒、細(xì)胞、半固體表面(例如凝膠)和固體表面綴合。

因此，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的另外的方面，提供了包含連接基的染料化合物，該連接基使得能夠?qū)崿F(xiàn)例如共價(jià)附接至這類底物部分。