[發明專利]多重核酸檢測方法

有效

• 申請號: 201380072327.3
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN104995309B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: E·奧利瓦瑞斯;J·索倫森;T·蘭德斯
• 申請（專利權）人: 因維蒂公司
• 主分類號: C12Q1/6874
• 分類號: C12Q1/6874;C12M1/36;C12M1/34;C12M1/00
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平

用于多重連接依賴性探針擴增方法包括(a)提供含有不同靶核酸的樣品組織，(b)針對每個靶核酸提供不同的探針組，每個探針組包含具有第一接頭序列和第一靶特異性部分的第一基因座特異性探針及具有第二接頭序列和鄰近所述第一靶特異性部分的第二靶特異性部分的第二基因座特異性探針，(c)將所述探針組與所述靶序列雜交以形成雜交復合體；(d)連接所述雜交復合體以形成連接的探針，(e)擴增連接的探針以形成擴增子，和(f)通過對每個擴增子進行測序在檢測系統中檢測擴增子。

背景技術

本文所公開的實施方式涉及核酸，更特別地是涉及靶核酸序列多重檢測的方法。

多重連接依賴性探針擴增(MLPA)是允許在單次實驗中評估特別是多種靶核酸的拷貝數的多重PCR技術。在MLPA中，所查詢的每個靶核酸是通過連接的探針的擴增來檢測。連接的探針是通過探針組的雜交和連接產生，所述探針組包含一對設計為沿目標靶核酸序列彼此鄰近定位的半探針(half-probe)。只有在半探針與靶核酸雜交時，才發生連接和隨后的擴增。

圖1示出了典型的MLPA分析的流程圖。該分析起始于DNA樣品的變性和探針組與它們的靶核酸序列的雜交。在雜交后，連接鄰近的半探針，并使得到的連接的探針組經歷PCR擴增。然后通過毛細管電泳(CE)分析所擴增的連接的探針組。CE讀出結果的峰高度作為基因組靶拷貝數的讀出結果。

如圖1中所指示的，每個探針組由具有靶特異性序列和通用引物序列的5'和3'半探針組成，允許同時多重PCR擴增所有連接的探針組。另外，半探針中的一個(如圖1所示)或兩者進一步包括填充序列(stuffer sequence)，其使得更容易區分通過CE進行的擴增探針的檢測。使用使得基于核酸長度的CE檢測成為可能的這些填充序列對于可在單次運行中查詢(query)的靶核酸數量造成限制。目前，該限制是約40個靶核酸。由于與MLPA相關的低成本、高通量潛力和檢測小重排的能力，擴增可在單次運行中查詢的靶核酸序列的數量是有益的。本公開提供了用于查詢數量擴增的這樣的方法并也提供相關的優勢。

發明內容

根據在本文中說明的實施方式，提供了增加可在多重連接依賴性探針擴增(MLPA)分析中查詢的靶核酸數量的方法。

在一些方面，本文所公開的實施方式提供了用于多重連接依賴性探針擴增的方法，其包括(a)提供樣品組織以查詢多個不同的靶核酸；(b)為所述多個不同靶核酸中的每一個提供多個不同的探針組，其中每個探針組包含：第一基因座(locus)特異性探針，其包含第一接頭(adapter)序列和第一靶特異性部分；和第二基因座特異性探針，其包含第二接頭序列，和鄰近所述第一靶特異性部分的第二靶特異性部分；(c)將所述多個不同探針組與所述多個不同靶序列雜交以形成多個雜交復合體；(d)連接所述多個雜交復合體以形成多個連接的探針；(e)擴增所述多個連接的探針以形成多個擴增子，其中所述擴增步驟使用第一通用引物和第二通用引物進行，所述第一通用引物包含與所述第一接頭序列互補的區域，所述第二通用引物包含與所述第二接頭序列互補的區域；和(h)通過對所述多個擴增子的每一個進行測序，在檢測系統中與長度無關地檢測所述多個擴增子。

在其他方面，本文所公開的實施方式提供了方法，其包括提供檢測系統，所述檢測系統包括配置為在包含多個擴增子的陣列上進行合成測序循環的流體處理系統，所述檢測系統被配置為將輻射從源引導至所述陣列并將熒光發射從所述陣列引導至照相機，和包括配置為自動改變所述檢測系統以增加引導至所述陣列的所述輻射的暴露水平和在所述增加的暴露下檢測從所述陣列到所述照相機的熒光發射的系統控制界面；通過多重連接依賴性探針擴增提供所述多個擴增子；和測定所述多個擴增子的序列。

附圖說明

為更好地理解本實施方式，可參考附圖。

圖1示出了采用毛細管電泳檢測系統的多重連接依賴性探針擴增(MLPA)的流程圖。

圖2示出了根據本文所公開的實施方式的MLPA-合成測序(SBS)的流程圖。