[發明專利]IBV、CSFV和NDV的高分辨熔解基因分型

在審

• 申請號: 201380071551.0
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN104995315A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: J-C·奧多內;S·賈甘納坦
• 申請（專利權）人: 梅里亞股份有限公司;亞太特種營養私人有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 韓威威

相關申請的交叉引用

本申請要求2012年12月18日提交的美國臨時申請61/738,688的優先權。

技術領域

本發明涉及使用高分辨熔解技術區分和表征IBV、CSFV和NDV毒株和鑒定新毒株的方法。本發明還提供隨這類方法使用的底物和試劑盒。

發明背景

聚合酶鏈反應(PCR)是一種引物延伸反應，所述反應提供一種在體外擴增特定DNA或多核苷酸、產生數千個至數百萬個特定DNA序列副本的方法。PCR現在是醫學研究實驗室和生物學研究實驗室中用于多種應用的常見和經常不可替代的技術。這些應用包括用于測序、基于DNA的系統發生或基因功能分析的DNA克隆；診斷遺傳疾病；鑒定遺傳指紋；及檢測和診斷傳染病。基本PCR的某些變型包含定量實時PCR(qPCR或RT-PCR)、等位基因特異性PCR、非對稱PCR、熱啟動PCR、逆轉錄PCR、多重PCR、巢式PCR、連接介導的PCR、序列間特異性PCR、熱不對稱交錯PCR和溫度遞降PCR。這些PCR變型針對不同用途提供廣泛類型的用途。例如，可以通過等位基因特異性PCR鑒定單核苷酸多態性(SNP)(DNA中的單堿基差異)、qPCR可以在PCR反應中擴增的副本數目提供極高精度(Bartlett等人,“A?Short?History?of?the?Polymerase?Chain?Reaction”，PCR?Protocols,2003)。

最近，增加了高分辨熔解(HRM)法作為一種用于高通量突變掃描的新分子技術(Zhou,L.等人,Clin.Chern.51,1770-1777,2005)。使用HRM確定突變基于與雙鏈DNA相互作用的熒光染料存在下暴露于遞增溫度時DNA的解離(參見，例如US7,387,887；US7,582,429)。本領域中存在許多適宜的染料。突變的存在導致DNA異源雙鏈體形成，隨后熔解行為改變。因此，這種“突變掃描”技術檢測靶基因衍生的PCR擴增子中序列變異的存在。在HRM實驗中，首先在高分辨熔解染料存在下借助實時PCR擴增樣品DNA。這類染料的知名實例在WO?2008/052742中公開。在PCR后，后續熔解實驗可以在同一個實時儀上進行，并用相應的基因掃描軟件分析以鑒定序列變體。

經典豬瘟(CSF)，先前稱作豬霍亂，是一種侵襲家豬和野豬的高度接觸性和多系統出血性疾病，它在全球養豬業中造成經濟損失并且根據陸生動物衛生法典，是世界動物衛生組織法定報告疾病(OIE，2007)。致病因子是經典豬瘟病毒(CSFV)，它是一種有囊膜、正義、單鏈RNA病毒，歸屬于黃病毒科(Flaviviridae)的瘟病毒屬(Pestivirus)。在遺傳水平，基于E2基因和NS5B基因的部分序列，CSFV可以劃分成基因型1、2和3。每個基因型可以劃分成亞基因型，分別稱作1.1、1.2和1.3；2.1、2.2和2.3；以及3.1、3.2、3.3和3.4(Paton等人,Vet?Microbiol.73:137-157,2000)。在亞洲，CSF流行性是普遍存在的，并且已經在幾個亞洲國家分離基因型1、2和3。

CSFV可以引起急性、亞急性和慢性豬病，并且對全球養豬業造成重大威脅，造成嚴重經濟損失。CSF的控制涉及根除或接種，其中根除是在發達國家如歐盟(EU)的優選控制方法，因屠宰感染豬造成龐大數量的損失。在另一方面，接種是在發展中國家如中國的主要控制策略。豬瘟兔化病毒(HCLV)(也稱作C株)在二十世紀五十年代中期開發并且在中國和許多國家廣泛使用(Moorman等人,J?Virol.70:763-770,1996)。用HCLV疫苗大規模接種造成在接種的豬群中難以區分CSFV的野生型株和HCLV株(Van?Oirshot,Vet?Microbiol?96:367-384,2003)。CSFV亞臨床感染和無癥狀感染是普遍存在的(Moennig等人,Vet.J.165,11-20,2003；Tu,Virus?Res.81,29-37,2001)，產生無法由農民和獸醫師可容易識別及無法通過一般檢測法如病毒分離、抗原捕獲ELISA和熒光抗體試驗可檢出的野生型CSFV感染。