[發明專利]改進過表達堿性磷酸酶的釀酒酵母重組菌株中乙醇產率并減少生物質積累

有效

• 申請號: 201380071011.2
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN104937098B
• 公開（公告）日: 2023-02-21
• 發明（設計）人: 瑪爾塔·塞姆基夫;康斯坦丁·迪米特拉克;安德烈·A·希博尼;查爾斯·阿巴斯
• 申請（專利權）人: 阿徹丹尼爾斯米德蘭德公司;細胞生物學研究所
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P7/10;C12P7/06;C12P19/34
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 李平;鄭霞

在此描述了一種方法，該方法在酒精發酵過程中通過表達編碼液泡或細胞溶質形式的堿性磷酸酶的截短形式的釀酒酵母PHO8基因增加乙醇產率，其表達降低了生物質積累同時將較大的碳轉移給乙醇生產。還描述了用于表達該PHO8基因的核酸序列和載體以及運載它們的菌株。包含編碼液泡形式的堿性磷酸酶的完整PHO8基因的菌株已經輕微地降低細胞內的ATP水平，其中生物質積累改變不顯著并且乙醇生產增加高達13％。

相關申請的交叉引用

本申請要求2012年12月20日提交的美國臨時專利申請號61/739,904的優先權。

技術領域

本發明涉及通過發酵生產乙醇的領域，并且更具體地說涉及在釀酒酵母中表達堿性磷酸酶e基因以改進乙醇的生產同時減少生物質積累。

發明背景

酒精發酵表示了在工業生物技術的領域中的釀酒酵母的最大應用，其中在2011年超過800億升的燃料、工業和飲料乙醇的生產。在過去的十年并且由于經濟和環境原因，世界范圍內的燃料乙醇的生產已經經歷了指數式增長(Schubert，2006)。雖然木質纖維素被認為是用于生產燃料乙醇最有希望的原料之一，但是目前燃料乙醇的工業生產嚴重依賴于傳統原料(如，蔗糖(主要衍生自甘蔗或甜糖用甜菜)和從含淀粉材料獲得的葡萄糖(玉米、小麥、大麥、馬鈴薯等))的發酵。目前用于生物乙醇生產的最常見的生物是面包酵母、釀酒酵母。這種酵母菌通過糖酵解恩布頓-邁耶霍夫途徑(EMP)途徑分解代謝葡萄糖產生2摩爾ATP/摩爾消耗的葡萄糖。這種途徑在酵母菌中的效率是低的，其中最大的生物質產率約7％并且乙醇產率在理論值的90％與93％的范圍內(Ingledew，1999)。然而，轉化為細胞物質的7％的糖的工業規模代表巨大量的副產品，雖然這些副產品作為動物飼料是有價值的但是顯著地降低目標產品乙醇的總產率。即使通過釀酒酵母在乙醇產率上的輕微的改進，每年乙醇生產的全球產量可以增加幾百萬l升乙醇。

與釀酒酵母相對比，細菌運動發酵單胞菌通過恩特納-道德洛夫(ED)途徑發酵葡萄糖。這個途徑給出了僅僅1摩爾ATP/摩爾葡萄糖，并且將僅僅3％的葡萄糖引導至細胞生物質中實現了高達97％的可能的理論值的乙醇產率(Sprenger，1996)。這表明了在酒精發酵過程中降低ATP產率水平增加了乙醇產率，其中底物向細胞物質的轉化降低。此外，運動發酵單胞菌(Z.mobilis)具有超過釀酒酵母的另一個重要的優點：將葡萄糖更快的發酵成乙醇(Sprenger，1996，Panesar等人，2006)，運動發酵單胞菌的較高的繁殖力(productivity)通常歸因于較快的糖攝取速率以及隨后的分解代謝而不是低ATP產率。以用于生產工業乙醇的運動發酵單胞菌取代釀酒酵母的嘗試被認為增加了3％-4％的乙醇產率，由此全世界每年增加了幾億升。然而，運動發酵單胞菌具有幾個妨礙其工業用途的嚴重的缺點，并且這些缺點由以下各項組成：(i)非常狹窄的底物范圍(蔗糖幾乎不發酵，具有低的產率)，(ii)賴氨酸、蛋氨酸和一些維生素的天然營養缺陷體，(iii)非GRAS的狀態，其阻止了作為飼料添加劑的生物質的使用，(iv)用于生長的較高的pH的需要(Jeffries，2005；Bai等人，2008；阿巴斯，未公開出版的發現)。此外，用于酒精發酵的酵母菌細胞的技術很好地發展，然而用于乙醇生產的細菌細胞的使用是很不常見的。因此，一種增加乙醇產率并且減少細胞物質生產的更好的方法是構建在酒精發酵過程中產生更少的ATP(例如，一摩爾ATP，如運動發酵單胞菌在ED途徑中產生的)的酵母菌菌株。這些新的酵母菌菌株將酵母菌的所有的可能的優點與運動發酵單胞菌的高的乙醇產率結合。存在幾種可以用于實現這個目標的方法，例如：由來自擁有該途徑的基因的運動發酵單胞菌或其他細菌的ED途徑取代酵母菌中的EMP途徑；增加在無效循環的產生中所涉及的酶的活性；構建具有提高的ATP酶活性的重組菌株；并且引入編碼質膜同向轉運體的異源基因。