[發明專利]多個不同的核酸靶序列同時擴增的方法

無效

• 申請號: 201380067456.3
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN104919056A
• 公開（公告）日: 2015-09-16
• 發明（設計）人: 約亨·金特;邁克爾·賽恩瑞馳
• 申請（專利權）人: 巴塞爾大學醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京市隆安律師事務所 11323
• 代理人: 劉東方

1.一種使多個不同的核酸靶序列同時擴增的方法，其包括以下步驟：

提供一組能使相同核苷酸序列退火的正向引物寡核苷酸，所述組包括具有5’-X-N’-3’結構的第一正向引物寡核苷酸和具有5’-X-N¹-N²-3’結構的第二正向引物寡核苷酸，

其中X是能使第一引物退火序列退火的核苷酸序列，N¹為無或者由一個或多個核苷酸組成，并且N²由一個或多個核苷酸組成；

提供多個不同的核酸聚合物用作模板，每個模板包括：(i)與核苷酸序列X互補的正向引物退火序列X’，和(ii)特異性靶序列；以及

利用所述組的正向引物寡核苷酸和一個或多個反向引物寡核苷酸，通過聚合酶依賴性擴增反應使模板擴增，其特征在于，第一正向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸當使模板退火時與至少兩個不同的模板序列完全匹配，并且所述第二正向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸當使模板退火時與所述至少兩個不同的模板序列中的至少一個錯配并且與所述至少兩個不同的模板序列中的至少一個完全匹配。

2.權利要求1所述的方法，其進一步包括提供一組能使相同核苷酸序列退火的反向引物寡核苷酸的步驟，包括具有5’-Y-M¹-3’結構的第一反向引物寡核苷酸和具有5’-Y-M¹-M²-3’結構的第二反向引物寡核苷酸，

其中Y是能使反向引物退火序列退火的核苷酸序列，M¹為無或者由一個或多個核苷酸組成，并且M²由一個或多個核苷酸組成；

其中每個模板進一步包括與核苷酸序列Y互補的反向引物退火序列，靶序列位于正向引物退火序列和反向引物退火序列之間，并且所述聚合酶依賴性擴增反應是利用所述組的正向引物寡核苷酸和所述組的反向引物寡核苷酸進行的，

其特征在于，所述第一反向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸當使模板退火時與至少兩個不同的模板序列完全匹配，并且所述第二反向引物寡核苷酸的3’末端核苷酸當使模板退火時與所述至少兩個不同的模板序列中的至少一個錯配并且與所述至少兩個不同的模板序列中的至少一個完全匹配。

3.權利要求2所述的方法，其中模板的數量為v，并且每個模板包括5’-X-et^Xw-T^w-et^Y’w-Y’-3’結構

其中

v是大于1的整數，

w是1至v的整數，每個特定的模板分配一個單獨的w值，

X如權利要求1所定義，

et^Xw是第一效率標簽序列，

T^w是靶序列或其互補，

et^Y’w是第二效率標簽序列的互補序列，

Y’是反向引物退火序列。

4.權利要求3所述的方法，其特征在于每個效率標簽序列包含2至10個核苷酸，優選2至7個核苷酸，更優選3至5個核苷酸。

5.權利要求3或4所述的方法，其特征在于每個模板均由下述步驟提供：

提供一種單鏈原始核酸聚合物，其包含一個待擴增的原始靶序列；

雜交到寡核苷酸探針上的原始靶序列的5’末端，所述寡核苷酸探針序列包含與原始靶序列5’末端互補的靶序列的一部分、引物退火序列和效率標簽序列，并且與另一個寡核苷酸探針上的原始靶序列的3’末端雜交，另一個寡核苷酸探針序列包含與原始靶序列的3’末端互補的靶序列的一部分、引物退火互補序列和效率標簽互補序列；

通過聚合酶和連接酶合成與原始靶序列互補的鏈以產生模板；以及

分離所產生的模板。

6.權利要求5所述的方法，其特征在于所產生的模板的末端被保護抗核酸外切酶。

7.權利要求5或6所述的方法，其特征在于所產生的模板包含游離末端、雙末端區域中的一個或多個核苷酸被修飾以形成核酸外切酶保護。

8.權利要求7所述的方法，其特征在于所述一個或多個經修飾的核苷酸是被硫代磷酸化。

9.權利要求5至8中任一項所述的方法，其特征在于分離所產生的模板的步驟是利用核酸外切酶消化剩余的核酸組分而進行的。