[發明專利]多個不同的核酸靶序列同時擴增的方法

無效

• 申請號: 201380067456.3
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN104919056A
• 公開（公告）日: 2015-09-16
• 發明（設計）人: 約亨·金特;邁克爾·賽恩瑞馳
• 申請（專利權）人: 巴塞爾大學醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京市隆安律師事務所 11323
• 代理人: 劉東方

技術領域

本發明涉及多個不同的核酸靶序列同時擴增的方法，以及一種用于實施所述方法的試劑盒和一種核酸聚合物文庫，特別是DNA或RNA文庫。本發明還涉及該方法在基因探針檢測以及分子克隆中的用途。

背景技術

特異性核酸聚合物的檢測是診斷醫學和分子生物學研究的一個重要工具。基因探針檢測目前例如在鑒別傳染性有機體(Organism)例如細菌和病毒、在探測正常基因的表達以及在鑒別突變基因例如癌基因中、在組織移植前的組織分型兼容性中、在法醫學中匹配組織或血液樣品中、以及在研究來自不同物種的基因的同源性中發揮著作用。

理想情況下，基因探針檢測應該是敏感的、特異性的并且易于自動化。對靈敏度(即低檢測限)的要求已通過聚合酶鏈式反應(PCR)以及允許研究人員在分析之前對特異性靶序列進行指數擴增的其他擴增技術的發展而被大大提高。PCR技術為例如US-B-4,683,202中所描述的。

在過去幾年中，通過開發新技術的而取得了進展，該新技術有望降低成本并加速新分子診斷的開發。DNA分析儀在序列分析能力上變得日益增強。DNA重測序微陣列(Chee等人，1996；Patil等人，2001)和高通量平行測序儀(Margulies等人，2005；Shendure等人，2005)目前用于低復雜度基因組的全基因組分析到低至單一核苷酸分離。然而，人類基因組仍然太大以至于如不通過特異性序列定向擴增來降低復雜度而無法實現。為了匹配這些儀器的通量，需要更有效的技術來解決擴增瓶頸。對于全基因組測序成本一小部分的人類外顯子的全面重測序，靶序列的富集因此成為了關鍵。最近開發了幾種序列捕獲方法，例如分子倒置探針技術(Dahl等人，2007；Dahl等人，2005；Porreca等人，2007)；利用微陣列技術的方法(Okou等人，2007；Hodges等人，2007；Albert等人，2007)；利用RNA寡聚捕獲探針在溶液中雜交的技術(Gnirke等人，2009)、或者利用小液滴的乳液PCR的微流體技術(Tewhey等人，2009年)。

理論上，目前最有力和最快速的擴增技術是PCR并已被廣泛用于分子診斷。為了提高檢測通量并能更有效地利用寶貴的DNA樣本，通過將許多特異性引物對結合到個體PCR中以進行幾個靶標的同時擴增(Chamberlain等人，1988；Shigemori等人，2005)。然而，這是一個與PCR相關的至關重要的問題是當大量的特異性引物對被加入到相同的反應物中時，正確和不正確的擴增子均產生。此外，即使當可避免引物二聚體并且實現特異性擴增時，由于擴增子長度和序列屬性(GC含量)而使靶標具有不同的PCR效率。在后來的階段，在許多擴增子丟失從而有利于高效擴增的擴增子和贗品的情況下，這影響了產品的均勻性。為了優化多重PCR，需要憑經驗確定用于每組引物組合的引物、緩沖液dNTP、酶和氯化鎂的濃度。這是個耗時的工藝，該工藝需要進行所生產的每個批次的檢測。即使經過詳盡的優化實驗，也不能保證多重PCR成功。

即使在多重化情形下精心設計引物，PCR通常也僅限于10-20次同時反應，之后收率和均勻性由于不相關的擴增產物的累積而降低(2005；Broude等人，2001)。因此，每當需要分析許多基因組序列時，通常進行大量的單獨的PCR。因此，多重PCR的主要挑戰是要克服兩個主要問題：導致非特異性擴增(例如引物二聚體)的引物不相容性以及不同靶標的擴增效率的差異性。

考慮到現有技術水平的方法的缺點，因此本發明待解決的問題是提供一種簡單、快速和便宜的用于同時擴增多個不同的核酸靶序列的方法，特別是DNA和/或RNA靶序列。在此方面，所述方法應允許幾乎所有靶序列以比傳統方法特別是標準PCR更均勻的豐度擴增。本發明提供了一種新穎的多重化技術，解決這兩個基本的問題，從而允許在一個單一反應中進行多個靶標的均勻擴增。

發明內容

方法論原則

效率標簽PCR