[發明專利]胡蘿卜素羥化酶及其用于產生類胡蘿卜素的用途

在審

• 申請號: 201380066965.4
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN105308180A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: C·法雷爾;M·馬約爾加;B·謝弗勒
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12P23/00
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 史悅

發明背景

本發明涉及新的羥化酶、編碼它的核酸序列、包含此序列的表達構建體和載體、用其轉化的微生物、用于類異戊二烯的微生物羥化的方法，例如，用于將β-胡蘿卜素轉變成β-隱黃素或玉米黃質以及將角黃素轉變成蝦青素的方法。

類胡蘿卜素是顏色在黃色至紅色范圍內的有機色素，其由一些生物包括光合生物(例如，植物、藻類、藍藻)和一些真菌天然產生。

類胡蘿卜素如葉黃素、玉米黃質或蝦青素是在人和牲畜飲食中作為色素物質和維生素A衍生物的前體的非常重要的添加劑。此外，類胡蘿卜素具有促進健康的作用如增強免疫應答，而且由于其抗氧化劑特性的原因具有預防癌癥的作用，這使其用作感興趣的保健品(nutraceutical)。因此用于制備類胡蘿卜素的經濟方法和具有增加的類胡蘿卜素含量的食品至關重要。用于制備類胡蘿卜素的特別經濟的方法是生物技術方法，其利用來自產生類胡蘿卜素的生物的類胡蘿卜素生物合成的生物合成基因和蛋白。

經由β-隱黃素催化β-胡蘿卜素酶法轉變成玉米黃質的原核β-胡蘿卜素羥化酶和編碼這些蛋白的基因已知來自噬夏孢歐文氏菌(Erwiniauredovora)(Misawa等,J.ofBacteriology1990,6704-6712；EP393690B1)、草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)(WO9113078)、橙黃土壤桿菌(Agrobacteriumaurantiacum)(Misawa等,J.ofBacteriology1995,6575-6584；EP735137A1)、產堿菌屬菌種(Alcaligenessp.)PC-1(EP735137A1)、黃桿菌屬菌種(Flavobacteriumsp.)菌株R1534(Pasamontes等,Gene1997,185,35-41；EP747483A2)和來自藍藻集胞藻屬(CyanobacteriumSynechocystis)PCC6803(Masamoto等,PlantCellPhysiol.1998,39(5),560-564)。

還已知來自橙黃土壤桿菌、產堿菌屬和噬夏孢歐文氏菌的原核β-胡蘿卜素羥化酶還能夠將角黃素經由金盞花紅素(adonirubin)轉變成蝦青素(Misawa等,J.ofBacteriology1995,6575-6584；Fraser等,J.Biol.Chem.1997,272,6128-6135)。

已知來自真核來源的三種植物β-胡蘿卜素羥化酶可催化β-胡蘿卜素經由β-隱黃素酶法轉變成玉米黃質。相應的cDNA已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Cunningham等,J.Biol.Chem.1996,271,24349-24352,WO9736998)和辣椒(CapsicumannuumL.)中分離。

真核來源的基因相對于原核基因具有優勢，其在更高等的轉基因生物如植物中表達更佳。盡管如此，仍然需要改進和增加類胡蘿卜素生產力用于通過將真核核酸并入生物體而制備類胡蘿卜素衍生物或具有增加的類胡蘿卜素含量的食品的方法。

此外，現有技術中適當的真核β-胡蘿卜素羥化酶具有它們僅有窄的底物范圍的缺點使得存在不能由羥化酶轉變且可對羥化酶發揮抑制效果的代謝產物的積累。

發明概述

本發明的目標之一是改正現有技術的所述缺陷并提供具有改進特性的真核胡蘿卜素羥化酶。

發明人發現通過包含氨基酸序列SEQIDNO:2的具有羥化類異戊二烯(例如，β-胡蘿卜素或角黃素)酶活性的蛋白可令人驚訝地實現上述目標。

因此，本發明涉及包含氨基酸序列SEQIDNO:2的蛋白或多肽，或源自此序列通過氨基酸的取代、插入或缺失并與序列SEQIDNO:2在氨基酸水平具有至少50％同源性的序列。

特別地，根據本發明的羥化酶如果在所選的或能夠產生特定類胡蘿卜素(例如玉米黃質或蝦青素)的菌株中表達，與未用編碼根據本發明的蛋白或多肽的基因轉化的菌株相比，可增加這些類胡蘿卜素的水平。

本發明還涉及編碼本發明的多肽的分離的多核苷酸、包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細胞，并涉及產生所述多肽的方法。