[發(fā)明專利]用于從混合物富集突變核酸的化合物和方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380066924.5
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN104903464A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A.古普塔;N.舍恩布倫納
• 申請（專利權(quán)）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07F15/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 杜艷玲;黃希貴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及核酸化學(xué)和核酸擴(kuò)增的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及使用可以檢測核酸中的堿基對錯(cuò)配的化合物和方法富集低豐度突變靶核酸。

背景技術(shù)

已知大多數(shù)人遺傳疾病和癌癥由核基因中的突變造成。一般而言，認(rèn)為突變是遺傳基因座處的特定多態(tài)變體。所述突變可以是單個(gè)核苷酸差異，經(jīng)常被稱作點(diǎn)突變。在細(xì)胞和組織水平，在特定遺傳基因座處的多態(tài)性可以導(dǎo)致顯著改變的細(xì)胞行為。但是，因?yàn)榧词瓜鄬^小的細(xì)胞或組織樣品可以含有數(shù)百萬或數(shù)十億含有該特定遺傳基因座的DNA分子，在遺傳基因座處的多態(tài)變體的范圍和頻率的表示需要檢測潛在地以非常低頻率存在的等位基因。在大多數(shù)情況下，由于非常過量的野生型DNA的同時(shí)存在，來自生物樣品的罕見突變的存在的檢測提出了巨大的挑戰(zhàn)。

因此，本領(lǐng)域中需要選擇性地和準(zhǔn)確地富集低拷貝突變體DNA的方法，使得它們的存在在執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)（諸如PCR）以后可以是可檢測的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及用于富集樣品中的低豐度等位基因(例如突變體DNA)的方法和組合物，所述樣品允許隨后檢測這樣的等位基因。在第一方面，本發(fā)明涉及從樣品富集核酸混合物中的靶核酸序列變體的方法，所述靶核酸以兩種變體序列的形式存在，其中所述變體在單個(gè)核苷酸位置處不同，所述方法包括，提供包括所述靶核酸序列的樣品，其中所述要富集的變體在大量過量的其它變體中以低豐度存在于所述樣品中；提供與所述靶核酸序列的一條鏈互補(bǔ)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述單個(gè)核苷酸位置處具有與要富集的變體的錯(cuò)配且在所述單個(gè)核苷酸位置處與所述其它變體完美匹配；提供適合于所述寡核苷酸與所述靶核酸雜交的條件，以產(chǎn)生由所述寡核苷酸和所述靶核酸序列的任一種變體的一條鏈組成的雙鏈體多核苷酸；使所述雙鏈體多核苷酸與連接至親和標(biāo)記物的錯(cuò)配嵌入化合物接觸以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中所述錯(cuò)配嵌入化合物能夠結(jié)合所述含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸且不能結(jié)合所述不含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸；使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)識別和結(jié)合所述錯(cuò)配嵌入化合物上的親和標(biāo)記物；洗滌所述反應(yīng)混合物和使所述親和基質(zhì)與未結(jié)合所述親和基質(zhì)的所有材料分離；和提供緩沖液以從所述親和基質(zhì)洗脫核酸，和收集洗脫的含有富集的靶核酸序列變體的緩沖液。

在第二方面，本發(fā)明涉及從樣品檢測核酸混合物中的靶核酸序列的突變體等位基因的方法，其中所述突變體等位基因在單個(gè)核苷酸位置處與野生型等位基因不同且在大量過量的野生型等位基因中以低豐度存在于所述樣品中，所述方法包括，富集所述樣品中的突變體等位基因，其中所述富集如下進(jìn)行：提供與所述靶核酸序列的一條鏈互補(bǔ)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述單個(gè)核苷酸位置處具有與所述突變體等位基因的錯(cuò)配且在所述單個(gè)核苷酸位置處與所述野生型等位基因完美匹配；提供適合于所述寡核苷酸與所述靶核酸雜交的條件，以產(chǎn)生由所述寡核苷酸以及所述突變體等位基因或所述野生型等位基因的一條鏈組成的雙鏈體多核苷酸；使所述雙鏈體多核苷酸與連接至親和標(biāo)記物的錯(cuò)配嵌入化合物接觸以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中所述錯(cuò)配嵌入化合物能夠結(jié)合所述含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸且不能結(jié)合所述不含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸；使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)識別和結(jié)合所述錯(cuò)配嵌入化合物上的親和標(biāo)記物；洗滌所述反應(yīng)混合物和使所述親和基質(zhì)與未結(jié)合所述親和基質(zhì)的所有材料分離；和提供緩沖液以從所述親和基質(zhì)洗脫核酸，和收集洗脫的含有富集的突變體等位基因的緩沖液；擴(kuò)增所述富集的突變體等位基因；和檢測富集的擴(kuò)增的突變體等位基因的產(chǎn)物或從所述富集的擴(kuò)增的突變體等位基因產(chǎn)生的信號。

在第三方面，本發(fā)明涉及從樣品富集核酸混合物中的靶核酸序列變體的方法，所述靶核酸以兩種變體序列的形式存在，其中所述變體在單個(gè)核苷酸位置處不同，所述方法包括：提供包括所述靶核酸序列的樣品，其中所述要富集的變體在大量過量的其它變體中以低豐度存在于所述樣品中；加熱所述樣品，使得核酸的混合物變性；提供適合于所述靶核酸的重退火的條件，其中可以在一種變體序列的一條鏈和其它變體序列的一條鏈之間形成雙鏈體多核苷酸，以在所述變體存在差異的單個(gè)核苷酸位置處產(chǎn)生錯(cuò)配；使所述雙鏈體多核苷酸與連接至親和標(biāo)記物的錯(cuò)配嵌入化合物接觸以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中所述錯(cuò)配嵌入化合物能夠結(jié)合所述含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸且不能結(jié)合所述不含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸；使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)識別和結(jié)合所述錯(cuò)配嵌入化合物上的親和標(biāo)記物；洗滌所述反應(yīng)混合物和使所述親和基質(zhì)與未結(jié)合所述親和基質(zhì)的所有材料分離；和提供緩沖液以從所述親和基質(zhì)洗脫核酸，和收集洗脫的含有富集的靶核酸序列變體的緩沖液。