[發(fā)明專利]用于從混合物富集突變核酸的化合物和方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201380066924.5 | 申請日： | 2013-12-19 |
| 公開（公告）號： | CN104903464A | 公開（公告）日： | 2015-09-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | A.古普塔;N.舍恩布倫納 | 申請（專利權(quán)）人： | 霍夫曼－拉羅奇有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C07F15/00 |
| 代理公司： | 中國專利代理(香港)有限公司 72001 | 代理人： | 杜艷玲;黃希貴 |
| 地址： | 瑞士*** | 國省代碼： | 瑞士;CH |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 混合物 富集 突變 核酸 化合物 方法 | ||
1.一種從樣品富集核酸混合物中的靶核酸序列變體的方法，所述靶核酸以兩種變體序列的形式存在，其中所述變體在單個(gè)核苷酸位置處不同，所述方法包括：
提供包括所述靶核酸序列的樣品，其中所述要富集的變體在大量過量的其它變體中以低豐度存在于所述樣品中；
提供與所述靶核酸序列的一條鏈互補(bǔ)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述單個(gè)核苷酸位置處具有與要富集的變體的錯(cuò)配且在所述單個(gè)核苷酸位置處與所述其它變體完美匹配；
提供適合于所述寡核苷酸與所述靶核酸雜交的條件，以產(chǎn)生由所述寡核苷酸和所述靶核酸序列的任一種變體的一條鏈組成的雙鏈體多核苷酸；
使所述雙鏈體多核苷酸與連接至親和標(biāo)記物的錯(cuò)配嵌入化合物接觸以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中所述錯(cuò)配嵌入化合物能夠結(jié)合所述含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸且不能結(jié)合所述不含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸；
使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)識別和結(jié)合所述錯(cuò)配嵌入化合物上的親和標(biāo)記物；
洗滌所述反應(yīng)混合物和使所述親和基質(zhì)與未結(jié)合所述親和基質(zhì)的所有材料分離；和
提供緩沖液以從所述親和基質(zhì)洗脫核酸，和收集洗脫的含有富集的靶核酸序列變體的緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述具有親和標(biāo)記物的錯(cuò)配嵌入化合物是Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-生物素)3+。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述要富集的變體是突變體等位基因，且其它變體是野生型等位基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述突變體等位基因是突變體EGFR等位基因，且所述野生型等位基因是野生型EGFR等位基因。
5.一種用于從樣品檢測核酸混合物中的靶核酸序列的突變體等位基因的方法，其中所述突變體等位基因在單個(gè)核苷酸位置處與野生型等位基因不同且在大量過量的野生型等位基因中以低豐度存在于所述樣品中，所述方法包括：
富集所述樣品中的突變體等位基因，其中所述富集如下進(jìn)行：
提供與所述靶核酸序列的一條鏈互補(bǔ)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述單個(gè)核苷酸位置處具有與所述突變體等位基因的錯(cuò)配且在所述單個(gè)核苷酸位置處與所述野生型等位基因完美匹配；
提供適合于所述寡核苷酸與所述靶核酸雜交的條件，以產(chǎn)生由所述寡核苷酸以及所述突變體等位基因或所述野生型等位基因的一條鏈組成的雙鏈體多核苷酸;
使所述雙鏈體多核苷酸與連接至親和標(biāo)記物的錯(cuò)配嵌入化合物接觸以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中所述錯(cuò)配嵌入化合物能夠結(jié)合所述含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸且不能結(jié)合所述不含有錯(cuò)配的雙鏈體多核苷酸；
使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)識別和結(jié)合所述錯(cuò)配嵌入化合物上的親和標(biāo)記物；
洗滌所述反應(yīng)混合物和使所述親和基質(zhì)與未結(jié)合所述親和基質(zhì)的所有材料分離；和
提供緩沖液以從所述親和基質(zhì)洗脫核酸，和收集洗脫的含有富集的突變體等位基因的緩沖液；
擴(kuò)增所述富集的突變體等位基因；和
檢測富集的擴(kuò)增的突變體等位基因的產(chǎn)物或從所述富集的擴(kuò)增的突變體等位基因產(chǎn)生的信號。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述具有親和標(biāo)記物的錯(cuò)配嵌入化合物是Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-生物素)3+。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述突變體等位基因是突變體EGFR等位基因，且所述野生型等位基因是野生型EGFR等位基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增步驟用等位基因特異性的引物進(jìn)行。
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