[發(fā)明專利]用于高效率且高通量產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因事件的改進(jìn)的大豆轉(zhuǎn)化

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380066609.2
• 申請日: 2013-12-18
• 公開（公告）號: CN104869809A
• 公開（公告）日: 2015-08-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: D·帕雷迪;S·R·契納雷迪;T·明尼克斯;O·卡爾波娃;D·格里芬;J·P·塞繆爾;K·A·史密斯;R·薩莉亞-米蘭;T·K·瑪爾
• 申請（專利權(quán)）人: 美國陶氏益農(nóng)公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H1/06;C12N15/82;C12N5/04
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所 11494
• 代理人: 羅天樂

優(yōu)先權(quán)聲明

本申請要求獲得2012年12月19日提交的題為“用于高效和高通量產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因事件的改良大豆轉(zhuǎn)化方法(IMPROVED?SOYBEAN?TRANSFORMATION?FOR?EFFICIENT?AND?HIGH-THROUGHPUT?TRANSGENIC?EVENT?PRODUCTION)”的美國臨時專利申請系列號61/739,349的申請日的權(quán)益。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開涉及一般意義上的植物育種。提供了用于大豆轉(zhuǎn)化的方法。本公開的方法可用于轉(zhuǎn)基因大豆的高效率并且高通量的生產(chǎn)，和轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)開發(fā)。

背景

大豆(Glycine?max)是最重要的農(nóng)業(yè)作物之一，全世界每年的作物產(chǎn)量超過2億公噸，估計價值超過400億美元。大豆占全球油料種子生產(chǎn)的超過97％。因此，提高這種有價值的作物的質(zhì)量和產(chǎn)量的可靠而高效的方法具有顯著的利益。

用于改良大豆的傳統(tǒng)育種方法已經(jīng)受到限制，因為大部分的大豆栽培種僅源于少數(shù)幾個親本系，導(dǎo)致種質(zhì)育種基礎(chǔ)較窄。Christou等，TIBTECH8:145-151(1990)。現(xiàn)時的研究工作主要致力于在用植物基因工程技術(shù)來提高大豆產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因方法旨在將期望的基因?qū)氲阶魑镏参锏目蛇z傳種系中，以產(chǎn)生優(yōu)良的植物品系。這種策略已經(jīng)成功地增加了其它幾種作物植物對疾病、昆蟲和除草劑的抗性，同時提高了營養(yǎng)價值。

已經(jīng)開發(fā)出了多種用于將基因轉(zhuǎn)移到植物組織中的方法，包括高速微噴射、顯微注射、電穿孔和直接DNA攝取。最近，土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化已經(jīng)被用于將感興趣的基因?qū)氲酱蠖怪小Ｈ欢呀?jīng)證明，大豆對轉(zhuǎn)基因工程而言是一個具有挑戰(zhàn)性的系統(tǒng)。大豆的高效轉(zhuǎn)化和外植體的再生是難以實現(xiàn)的，并且經(jīng)常難以重復(fù)。

根癌土壤桿菌是一種致病性的土棲細(xì)菌，具有固有的將其DNA(稱為T-DNA)轉(zhuǎn)移到宿主植物細(xì)胞內(nèi)、并誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生可用于細(xì)菌營養(yǎng)的代謝物的能力。使用重組技術(shù)，可以將一些或全部的T-DNA用感興趣的基因取代，產(chǎn)生可用于轉(zhuǎn)化宿主植物的細(xì)菌載體。土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移通常針對植物培養(yǎng)物中未分化的細(xì)胞，但也可以針對從植物葉片或莖獲取的已分化細(xì)胞。已經(jīng)開發(fā)了多種用于大豆的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，它們可以根據(jù)被轉(zhuǎn)化的外植體組織加以松散的分類。

美國專利No.7,696,408，Olhoft等人公開了一種子葉節(jié)(cotyledonary?node)方法，用于轉(zhuǎn)化單子葉植物和雙子葉植物。“子葉節(jié)”方法涉及從5-7日齡大豆幼苗通過在子葉節(jié)的正下方切割除去下胚軸，切開并分離剩余的帶有子葉的下胚軸節(jié)段，并從子葉除去上胚軸(epicotyl)。將子葉外植體在腋芽和/或子葉節(jié)的區(qū)域中造傷口(wounded)，并與根癌土壤桿菌在黑暗中培養(yǎng)五天。該方法需要在體外萌發(fā)種子，并且制造傷口步驟(wounding?step)會引入顯著的變數(shù)。

美國專利No.6,384,301，Martinelli等人公開了向來自從大豆種子切下的大豆胚的活分生組織中進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的基因傳遞，隨后用選擇劑和激素培養(yǎng)分生外植體，并誘導(dǎo)芽形成。與“子葉節(jié)”方法相似，優(yōu)選地在感染之前對分生外植體致傷。

美國專利No.7,473,822，Paz等人公開了一種改良的子葉節(jié)方法，稱作“半種子外植體”法。使成熟的大豆種子吸脹，表面滅菌，并沿著種臍切開。在感染之前，胚軸和芽被完全除去，但沒有其它的傷口出現(xiàn)。進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，選擇潛在轉(zhuǎn)化體，并在選擇培養(yǎng)基上再生外植體。

使用這些方法的轉(zhuǎn)化效率仍然相對較低，“子葉節(jié)”法在0.3％-2.8％的量級，“分生外植體”法為1.2-4.7％，“半種子外植體”法為3.2％-8.7％(整體4.9％)。本領(lǐng)域的典型轉(zhuǎn)化效率為大約3％。

改良的“分割種子”轉(zhuǎn)基因程序可以加速未來轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品的產(chǎn)生和發(fā)展。用于將轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合到大豆組織中的高效且高通量的方法將促進(jìn)育種進(jìn)程，并具有提高作物的產(chǎn)量的潛力。

公開

本公開涉及轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法。更特別地，本公開涉及用于轉(zhuǎn)化大豆(Glycine?max)的方法，其使用土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化分割的大豆種子，其中分割的大豆種子保留一部分胚軸。

附圖簡述

圖1顯示了pDAB9381的質(zhì)粒圖，根據(jù)特定的實施方案，該構(gòu)建體可用于土壤桿菌介導(dǎo)的大豆外植體的轉(zhuǎn)化。

圖2顯示了pDAB107533的質(zhì)粒圖，根據(jù)特定的實施方案，該構(gòu)建體可用于土壤桿菌介導(dǎo)的大豆外植體的轉(zhuǎn)化。