[發明專利]使用離子交換色譜來控制高甘露糖糖型的水平的方法

在審

• 申請號: 201380066603.5
• 申請日: 2013-12-18
• 公開（公告）號: CN105229498A
• 公開（公告）日: 2016-01-06
• 發明（設計）人: S·瑞簡德安;J·王
• 申請（專利權）人: 米迪繆尼有限公司
• 主分類號: G02B5/28
• 分類號: G02B5/28;C07K1/18
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶家蓉;沈端

背景

在細胞中合成的多肽經常經歷翻譯后修飾。靶向至內質網(ER)的大多數多肽被糖基化，即，在稱為糖基化的過程期間，酶促地將糖殘基(或寡糖)添加至多肽。糖基化的多肽也稱為糖蛋白。在真核細胞中，在ER的腔中，特定寡糖(包括14N-乙酰葡糖胺、甘露糖、和葡萄糖殘基)被附接至多肽的精氨酸殘基。因為寡糖總是轉移至精氨酸殘基的側鏈上的NH₂基團，所以這一寡糖稱為N-聯的或天冬酰胺聯的寡糖。N-聯寡糖被添加至序列天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇氨酸中存在的天冬酰胺殘基上，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，這兩個序列(Asn-X-Ser或Asn-X-Thr)的功能為N-聯糖基化的信號。此外，高爾基復合體中的一系列糖基轉移酶可以將糖殘基添加至多肽中的絲氨酸或蘇氨酸的羥基側鏈(OH)，這是一個稱為O-聯糖基化的過程。

在N-聯寡糖的附接后，可以在ER和高爾基復合體這二者中發生糖殘基的進一步修飾。在ER中，葡萄糖殘基可以與某些甘露糖殘基一起從寡糖修整。在高爾基復合體中，多種酶起到移除甘露糖殘基和/或添加其他糖殘基(包括N-乙酰葡糖胺、半乳糖、和唾液酸)的作用。在成熟糖蛋白中發現了兩大類N-聯寡糖：復合寡糖和高甘露糖寡糖。在高爾基復合體中，高甘露糖寡糖典型地沒有添加至它們的新糖。它們包含兩個N-乙酰葡糖胺和多個甘露糖殘基，最初存在于附接至ER中的多肽的寡糖前體中的通常接近數字(9)。從另一方面來說，復合寡糖可以包含多于一個的原兩個N-乙酰葡糖胺連同可變個數的半乳糖和唾液酸殘基，并且在某些例子中，是海藻糖。唾液酸殘基的獨特性在于它們是僅有的帶有凈負電荷的糖蛋白的糖殘基。

多肽的糖基化可以影響它們的特性和功能。例如，抗體分子的糖基化可以影響重要的免疫系統功能，例如抗原的補體活化、從身體的清除、以及效價。在IgG分子中，用于C1q的結合位點、補體活化的第一補體位于Fc區中的C_H2結構域(莫里森(Morrison)，S.L.等人，(1994)免疫學家(TheImmunologist)，2，119-124)。在抗體上高甘露糖寡糖(例如高甘露糖5)的存在通常導致從身體的更快清除，降低了它的效價(賴特(Wright)，A.等人(1998)免疫學雜志(JournalofImmunology)，160，3393-3402)。由于這些糖型對清除、免疫原性、和功效的作用，高水平的高甘露糖5糖型可以是治療性抗體的關注問題(帕西斯(Pacis)等人，(2011)生物技術與生物工程(BiotechnologyandBioengineering)，108(10):2348-58)。從另一方面來說，其他研究已經示出，高甘露糖抗體，產生于糖基化抑制劑的存在下，具有更大ADCC活性和對FcγRIIIa的更大親和力(帕西斯(Pacis)等人，(2011)生物技術與生物工程(BiotechnologyandBioengineering)，108(10):2348-58)。

抗體分子的糖基化典型地取決于細胞培養條件，包括其中培育抗體分子的宿主細胞和抗體的類型(拉朱(Raju)，T.S.(2003)生物過程國際(BioProcessInternational.)，4，44-53)。對于在制造治療性抗體期間控制高甘露糖5糖型的水平的目前所作努力是針對操縱細胞培養過程而不是純化過程(帕西斯(Pacis)等人，(2011)生物技術與生物工程(BiotechnologyandBioengineering)，108(10):2348-58)?？贵w的糖型水平典型地并不受下游純化過程條件的影響。

作為雜質的在治療性抗體中的高甘露糖糖型的存在會影響安全性或功效。然而，在其中旨在設計用于治療性抗體以觸發免疫系統來產生針對療法的抗體的情況下，一致地更高量的潛在更致免疫的高甘露糖糖型會是優選的。因此，對于在制造治療性抗體期間控制高甘露糖5糖型的水平存在需要，以便確保產品質量(安全性和功效)。本發明描述了可以用于獲得具有受控水平的高甘露糖糖型的治療性抗體的加工策略，取決于正制造的治療性抗體的特定需要。

發明概述

本披露提供了使用離子交換色譜來減少糖蛋白樣品(例如抗體樣品)中的高甘露糖糖型的量的方法。這些方法可以用于產生具有非常低水平的高甘露糖糖型的糖蛋白組合物。因此，另一方面針對包括糖蛋白(例如單克隆抗體)的組合物，其中該糖蛋白包括至少兩個N-聯寡糖，并且其中在該組合物中，小于2％的糖蛋白是高甘露糖糖型。