[發明專利]生產除草劑-抗性甜菜植物的方法

有效

• 申請號: 201380065688.5
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN105209622B
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 居伊·魏恩斯;馬克·勒菲弗;呂迪格·海因;格哈德·約翰
• 申請（專利權）人: 西斯凡德爾哈維公眾公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H3/04;A01H4/00;A01H5/06;A01H6/02
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 沈敬亭;李海霞

一種生產除草劑?抗性甜菜植物的方法，包括以下步驟：?從分離自甜菜植物的氣孔保衛細胞中獲得原生質體；?向該細胞施加組合物，該組合物含有以下濃度的ALS除草劑，該濃度對于所述細胞是致死的；以及?從存活細胞再生甜菜植物。

技術領域

本發明涉及一種生產對除草劑(例如乙酰羥酸合成酶(ALS，acetohydroxyacidsynthase enzyme)的抑制劑)有抗性的甜菜(糖用甜菜，sugar beet)植物的方法。

本發明進一步涉及通過該方法獲得的植物。

背景技術

甜菜在溫帶和亞熱帶地區是一種重要的農業作物。

在現代農業中，除草劑被廣泛地用于管理雜草增殖。

通過使用轉基因方法可以進行對一種或多種除草劑(如ALS抑制劑)有抗性的甜菜植物的生產(開發，develop)。

實際上，在各種大田作物中，包括在甜菜中，已經成功地完成了外源DNA的引入，該外源DNA攜帶賦予對除草劑的抗性的基因。

WO95/10178公開了一種轉基因誘導的對除草劑雙丙氨膦(bialaphos)的抗性。在甜菜的保衛細胞原生質體中引入編碼該抗性的基因，隨后將這些原生質體再生為甜菜植物。那些植物進一步對化學草胺膦和其衍生物草銨膦有抗性。

未轉化植物無法獲取對雙丙氨膦的抗性。

最佳地，83000原生質體再生成28個轉化的愈傷組織(calli)；最差地，190000原生質體再生成1個愈傷組織。隨后，這些愈傷組織中的一些可以示出體細胞胚胎發生(體胚發生，somatic embryogenesis)并且可以再生成甜菜苗，具有1％的效率，而發現非常有利的特征是高達30％。

然而這種方法在本領域中并不常用，該方法廣泛依賴于外植體的愈傷組織的更直接轉化，該外植體獲得自甜菜器官(如胚(胚芽，embryo))和/或葉盤。

對于開發抗除草劑植物(如在甜菜作物中)依然存在重要的需要，并且其不依賴于DNA載體和/或外源基因的插入。

另一方面，通過經典育種，利用將含有天然存在的抗性基因的甜菜植物在理論上可以進行對一種或多種除草劑(如ALS抑制劑)有抗性的甜菜植物的開發。然而，這樣的方法是費時的，并且就申請人掌握的知識，該方法沒有導致成功，盡管事實上至少對于除了甜菜以外的物種(包括各種雜草物種)，記載了天然存在的ALS抑制劑-抗性植物。特別地，雙重突變體(即，在相同的ALS基因中具有兩個突變的植物)在自然界非常不可能產生。

專利申請WO98/02527公開了一種制備對一些ALS抑制劑(如磺酰脲除草劑)有抗性的甜菜植物的方法，該方法包括以下步驟：將從甜菜(B.vulgaris)的外植體中獲得的愈傷組織暴露于磺酰脲，并且從少數的自發突變體再生植物，該突變體可以在這種除草劑存在下生長。

這種方法產生在ALS基因中具有突變的植物，其中，編碼的ALS酶的位置188(對應于擬南芥(Arabidopsis thaliana)ALS酶的197位置)處的脯氨酸由絲氨酸取代(代替)。然而，這種突變不是商業上使用的，因為利用優選的現代磺酰脲ALS除草劑(例如，甲酰胺磺隆)的處理在田間試驗中以必需劑量率表現出一些植物毒性。

專利申請WO2012/049268依賴于相同方法，不同之處在于從甜菜(B.vulgaris)的外植體獲得的愈傷組織暴露于甲酰胺磺隆，并因此導致甜菜植物對幾種ALS抑制劑(包括對甲酰胺磺隆)有抗性。

這種方法產生在ALS基因中具有突變的植物，其中，編碼的ALS酶的位置569(對應于擬南芥(Arabidopsis thaliana)ALS酶的574位置)處的色氨酸由亮氨酸取代。