[發(fā)明專利]抗-MIF抗體的細(xì)胞遷移測定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380064094.2
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN104884955A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: M·蒂塞爾;R·克西堡曼
• 申請（專利權(quán)）人: 巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/68
• 代理公司: 上海市華誠律師事務(wù)所 31210
• 代理人: 湯國華

本發(fā)明涉及一種測定方法，其適用于測試抗-MIF抗體的效價(jià)。特別地，本發(fā)明涉及一種有利的且易于使用的細(xì)胞遷移測定方法。

背景技術(shù)

巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)是一種細(xì)胞因子，最初基于其抑制結(jié)核菌素過敏豚鼠(含有巨噬細(xì)胞)的腹腔滲出細(xì)胞的體外隨機(jī)遷移能力而被分離(Bloom等，Science?1966年，153，80-2；David等，PNAS?1966年，56，72-7)。今天，MIF作為在具有廣譜活性先天性和獲得性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性上游調(diào)控子而被眾所周知。1989年，人的MIF的cDNA被克隆(Weiser等，PNAS?1989，86，7522-6)，其基因定位于22號染色體。人的MIF基因產(chǎn)物是具有114個(gè)氨基酸(N-末端蛋氨酸裂解后)且表觀分子量大約為12.5kDa的蛋白質(zhì)。MIF與任何其他的蛋白質(zhì)沒有顯著的序列同源性。該蛋白質(zhì)結(jié)晶為相同亞基的三聚體。每個(gè)單體包含兩個(gè)反向平行的α-螺旋，α-螺旋堆集成四鏈的β-折疊。所述單體具有另外兩個(gè)β鏈，該兩β鏈與相鄰亞單位的β-折疊相互作用從而形成單體之間的交界面。三個(gè)亞單位排布成一個(gè)包含親溶劑通道的管道，該管道沿分子的三重軸向穿過蛋白質(zhì)的中心(Sun等，PNAS?1996年，93，5191-5196)。

據(jù)報(bào)道，低濃度的糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌MIF(Calandra等，Nature?1995年，377，68-71)。然而，MIF也反向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的作用并刺激其它細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-1β的分泌(Baugh等，危重病急救醫(yī)學(xué)2002，30，S27-35)。MIF還顯示出，例如表現(xiàn)為促血管生成、促增殖和抗細(xì)胞凋亡的特性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(米切爾，R.A.，細(xì)胞信號，2004.16(1)：P.13-19；Lue，H.等，致癌基因2007.26(35)：p.5046-59)。它也與例如淋巴瘤，黑素瘤和結(jié)腸癌的生長直接有關(guān)(Nishihira等，J干擾素因子細(xì)胞因子研究2000，20：751-62)。MIF是許多病理狀況的中介體，因而與多種疾病相關(guān)，其包括但不限于炎癥性腸病(IBD)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、哮喘、血管球性腎炎、IgA腎病、心肌梗死(MI)、敗血癥和癌癥。

多克隆抗體和單克隆抗MIF抗體已被研發(fā)，用來抵抗重組的人MIF(清水等，二月快報(bào)1996；381，199-202；川口等，Leukoc生化學(xué)1986，39，223-232，和Weiser等。細(xì)胞免疫學(xué)1985，90，167-78)。

已經(jīng)有人建議抗MIF抗體用于治療用途。據(jù)報(bào)道，Calandra等(J.Inflamm.(1995)，47，39-51)使用抗MIF抗體保護(hù)動(dòng)物使其免于來自實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性敗血性休克。這表明抗MIF抗體可用作一種治療手段來調(diào)節(jié)感染性休克和其它炎性疾病狀態(tài)中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

美國專利6,645,493公開了來源于雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗MIF抗體，其能夠中和MIF的生物學(xué)活性。在動(dòng)物模型中表明這些源于小鼠的抗MIF抗體在內(nèi)毒素引起的休克的治療上取得了有益的效果。

美國專利200310235584公開了一種在動(dòng)物中制備MIF高親和性抗體的方法，其中MIF基因已經(jīng)被純合敲除。

Galat等人描述了糖基化抑制因子(GIF)是一種蛋白質(zhì)(歐洲生物化學(xué)，1994，224，417-21)。MIF和GIF現(xiàn)在被認(rèn)為是相似的。Watari等(PNAS2000，97，13251-6)描述了與不同的GIF表位結(jié)合的多克隆抗體，來識別Ts細(xì)胞的經(jīng)翻譯后修飾的GIF的生化性質(zhì)。同上，Watari等報(bào)告了體外GIF呈現(xiàn)出不同構(gòu)象的同工型。一類異構(gòu)體產(chǎn)生于單個(gè)半胱氨酸殘基的化學(xué)修飾。該化學(xué)修飾導(dǎo)致了GIF蛋白內(nèi)的構(gòu)象變化。

需要提供一種可靠且易于使用的測定方法來測試抗-MIF抗體的效價(jià)。在診斷和治療用途上，能夠明確給定抗-MIF抗體樣本的效價(jià)的方法是非常重要的。。如果不能清楚顯示出抗-MIF抗體的各自效價(jià)，則該方法不能用于任何診斷或治療。

對于MIF相關(guān)藥物，尤其是抗-MIF抗體的效價(jià)評估的穩(wěn)定的生物測定方法目前尚未知曉。

雖然在較早的測試中，MIF蛋白表現(xiàn)出趨化因子樣作用且這些功能可以被抗-MIF抗體阻斷(例如，Bernhagen等，自然醫(yī)學(xué)，2007)，但是迄今為止并沒有建立一種基于針對例如單核細(xì)胞的自分泌誘導(dǎo)細(xì)胞遷移進(jìn)行抑制合格的穩(wěn)定的MIF生物測定方法。