[發(fā)明專利]高純度和優(yōu)異產(chǎn)量的正確折疊的依那西普

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380058650.5
• 申請日: 2013-09-10
• 公開（公告）號: CN104902914B
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 荒川力;道格拉斯·法勒
• 申請（專利權(quán)）人: 科榮生生物科學(xué)公司
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;楊生平

提供了一種用于從給定蛋白質(zhì)的不正確折疊的構(gòu)象中分離正確折疊的構(gòu)象的混合模式色譜方法。所述方法在以商業(yè)上吸引人的產(chǎn)量從不正確折疊的依那西普和聚集體中分離正確折疊的依那西普方面是高度有效的，能夠提供在正確折疊的依那西普對不正確折疊的依那西普方面具有非常高純度的依那西普制備物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過本發(fā)明方法得到的含正確折疊的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制備物和制劑，和使用由所述混合模式方法得到的高純度制備物治療的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明通常涉及用于純化重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的層析分離方法，和從該方法得到的產(chǎn)物。更具體地，本發(fā)明涉及使用混合模式的層析法以純化重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物，包括，例如，可能包括不期望量的非正確折疊的和/或聚集的蛋白質(zhì)和適當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)的融合蛋白。本發(fā)明的混合模式層析方法特別有用于從不正確折疊的依那西普(如本文所定義的)中分離正確折疊的依那西普。本發(fā)明也涉及依那西普制備物和藥物制劑，其中已使用本公開的方法高產(chǎn)率和高純度地制備供應(yīng)其中的依那西普。本發(fā)明進(jìn)一步涉及采用高純度的以非常低水平的錯誤折疊的/聚集的蛋白質(zhì)為特征的依那西普治療TNF病況的方法。

背景技術(shù)

依那西普(Immunex Corporation制造)是由與人類免疫球蛋白G(“IgG1”)的Fc受體[片段，可結(jié)晶的]區(qū)域連接的人類75千道爾頓(p75)腫瘤壞死因子受體(“TNFR”)的細(xì)胞外配體結(jié)合部分組成的二聚融合多肽。依那西普由934個氨基酸組成并具有約150千道爾頓的表觀分子量(Physicians Desk Reference,2002,Medical EconomicsCompany,Inc.)。依那西普的Fc成分包含重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(CH2)、重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)和鉸鏈區(qū)，但不包括人類IgG1的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域1(CH1)。一個Fc域可包括一個或所有的上述域。

患有一些類型的炎性疾病例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斑塊狀銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎的人具有過度產(chǎn)生腫瘤壞死因子(“TNF”)的免疫系統(tǒng)。已發(fā)現(xiàn)施用依那西普對治療一些炎性疾病是有效的，因為它可通過作為誘餌受體結(jié)合TNF而降低受試者中活化型TNF的水平。

可通過重組DNA技術(shù)在中國倉鼠卵巢(“CHO”)的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中以已知的方式產(chǎn)生依那西普。不幸的是，由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)物包含大量的不正確或錯誤折疊和/或聚集的依那西普。對于藥物應(yīng)用，需要提供相對沒有不正確折疊的和聚集的蛋白質(zhì)的依那西普，因為所述不正確折疊的/聚集的蛋白質(zhì)將不具有與正確折疊的蛋白質(zhì)相同的治療效果，且可能實際上對患者是有害的。

錯誤折疊和聚集經(jīng)常發(fā)生在產(chǎn)生重組蛋白的過程中，并因此必須通過能夠從錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)中分離正確折疊的蛋白質(zhì)的下游過程進(jìn)行處理。錯誤折疊減少或消除蛋白質(zhì)的治療效果。通常被理解為涉及兩種或更多種依那西普同源二聚體的非共價聯(lián)合以形成非常高分子量物種的聚集導(dǎo)致相似的治療效果的損失，且當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)(包括錯誤折疊的蛋白質(zhì))積累并聚在一起時，聚集發(fā)生。如上所述，這樣的錯誤折疊的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體不僅是治療無效的，也可能是對患者有害的。相應(yīng)地，純化含依那西普的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物以使適當(dāng)折疊的依那西普從錯誤和/或積聚的依那西普中分離的能力對于得到提供最高可能程度的藥物可接受性的依那西普是重要的。

錯誤折疊和聚集的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生不是特定于依那西普的問題。具有許多治療性蛋白質(zhì)，對其來說錯誤折疊可能是一個問題。例如，在來自大腸桿菌包涵體的重組蛋白重折疊的過程中，含二硫化物的蛋白質(zhì)的錯誤折疊是難以避免的，但其可通過高分辨率的反相色譜法而被有效分離。然而，在反相色譜法中低pH和有機(jī)溶劑的使用在色譜分析過程中可使蛋白質(zhì)變性并可能引起純化的蛋白質(zhì)的聚集。