[發明專利]細菌設計

在審

• 申請號: 201380057726.2
• 申請日: 2013-11-05
• 公開（公告）號: CN104903446A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 戴維·休·威廉斯;阿瑟·基思·特納;約翰·理查德·韋恩
• 申請（專利權）人: 貝克特沃有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;宮傳芝

技術領域

本發明涉及設計(工程化，engineering)適用于生物技術應用，包括蛋白、次級代謝產物(secondary?metabolite)和生物燃料的生產，生物催化，生物治理(生物修復，bioremediation)，生物轉化，生物降解，生物學控制，藥物開發，藥物篩選，疫苗，益生菌，生物傳感器和藥物遞送載體(drug?delivery?vehicle)的細菌細胞的方法。

背景技術

細菌在生物技術的許多方面都找到了應用，包括用作生產異源蛋白和肽(包括酶和治療性抗體)的宿主，作為次級代謝產物或其衍生物的源，作為生物學控制，生物降解，生物燃料生產，生物催化和生物治理的試劑和作為益生菌，疫苗組分和藥物遞送體系。

天然細菌菌株對于生物技術用途并未優化。合成生物學這一新興領域的目標之一是設計(工程化，engineering)更易于處理和/或更有效的作為生物技術工具的新型生物。

一種方法可以稱為“粉碎(ground-up)”方法(例如，見WO2008/024129)。這涉及到只包含那些生長必不可少的基因的最小化的人工細菌DNA基因組的合成。這然后用于產生按照需要可以向其增加所需的生物合成路徑，信號傳導途徑或分解代謝功能的裸“框架”(bare“chassis”)。這種方法目前是不切實際的，因為基因產物和調控元件會協同和串擾于整個細胞的環境中，其方式當前還不完全理解并因此不能作為正式模塊進行處理。

另一種方法稱為“剝離(strip?down)”方法。目前這在鏈霉菌(Streptomyces?spp.)有用的次級代謝產物的生產中找到了應用。此處，不是生長必需的基因和其它遺傳物質將被去除(“剝除(stripped?out)”)，而逐個重新引入用于選定的生物合成路徑的那些。例如，Komatsu等(Komatsu?et?al.(2010)PNAS?107(6):2646-2651)描述了用于編碼次級代謝產物生物合成的基因的異源表達的設計的(工程化，engineered)細菌的構建，這涉及從工業微生物阿維鏈霉菌(Streptomyces?avermitilis)基因組中系統地刪除非必需基因。

所述“剝離”方法需要識別對于所選條件下存活和/或生長非必要的(和從而代謝高成本性的以及因此不利的)基因的方法。

此外，這種方法將受益于互補功能基因組分析還識別出有利于所提出的生物技術應用的基因。在后一種情況下，“剝離(strip?down)/增產(rev-up)”方法隨后能用于最小化由非必要(不利的)基因所引起的代謝負擔，同時放大直接或間接有助于所述生物技術應用的基因(即，有利基因)的有益作用。

轉座子定向插入位點測序(transposon?directed?insertion-site?sequencing)(TraDIS-見Langridge?et?al.(2009)Genome?Research?19:2308-2316)最近已經被描述并用于識別：(a)必需基因；(b)有利生長的(但非必需的)基因；(c)在特定條件下不利生長的基因；和(d)參與對某些條件提供耐受性的基因(“壁龕特異性的(niche-specific)”必需基因)。類似的技術已描述于例如，Gawronski?et?al.(2009)PNAS?106：16422-16427；Goodman?et?al.(2009)Cell?Host?Microbe?6:279-289；van?Opijnen?et?al.(2009)Nat.Methods?6:767-772和Gallagher?et?al.(2011)mBio?2(1):e00315-10，并且這種技術現在統稱為“Tn-seq”方法。

現在本發明人已經發現，TraDIS能夠適于為細菌生物設計(生物工程，bioengineering)目的明確地識別出不利的和有利的基因的問題提供非常巧妙的解決方案。這通過使用活化轉座子(Tn_A)而實現。這些轉座子包括啟動子從而使轉座子在合適的插入位點插入到細菌DNA中增加了插入位點處或接近基因的轉錄。因此采用Tn_A的誘變產生插入失活的突變體(其中所述Tn_A破壞了基因表達，通常在插入到編碼區中之后)以及插入活化的突變體(通常在轉座子已插入到基因的上游，從而使所述啟動子驅動所述基因高水平的轉錄(以及因此產生更高水平的表達)。

發明內容

根據本發明，提供了生產在選擇的生長條件下表現出改善的存活和/或生長的突變體細菌的方法，所述方法包括以下步驟：