[發明專利]細菌設計

在審

• 申請號: 201380057726.2
• 申請日: 2013-11-05
• 公開（公告）號: CN104903446A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 戴維·休·威廉斯;阿瑟·基思·特納;約翰·理查德·韋恩
• 申請（專利權）人: 貝克特沃有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;宮傳芝

1.一種在選擇的生長條件下表現出改善的存活和/或生長的突變體細菌的生產方法，所述方法包括以下步驟：

(a)通過采用活化轉座子(Tn_A)的轉座子誘變生產突變體細菌集合，其中所述Tn_A包含能夠增加其插入位點處或附近基因轉錄的啟動子；

(b)在所述選擇的生長條件下和在一種或多種參照條件下由突變體集合生長細菌從而產生兩種以上測試培養物；和

(c)比較測試培養物之間Tn_A插入的分布以識別出在所述選擇的生長條件下不利于生長和/或存活的第一類基因和在所述選擇的生長條件下有利于生長和/或存活的第二類基因。

2.根據權利要求1所述的方法，進一步包括提供其中至少一種所述不利基因被去除或破壞和/或至少一種所述有利基因過表達的設計的突變體細菌的步驟，使得所述突變體細菌在所述選擇的生長條件下表現出改善的存活和/或生長。

3.根據權利要求2所述的方法，其中多種所述不利基因被去除或破壞。

4.根據權利要求2或權利要求3所述的方法，其中多種所述有利基因過表達。

5.根據權利要求2-4中任一項所述的方法，進一步包括培養所述設計的突變體細菌并隨后對所述設計的突變體細菌實施權利要求1的步驟(a)-(c)以識別出在所述選擇的生長條件下不利于生長和/或存活的另外的第一類基因和在所述選擇的生長條件下有利于生長和/或存活的另外的第二類基因。

6.根據權利要求5所述的方法，進一步包括提供其中至少一種所述另外的不利基因被去除或破壞和/或至少一種所述另外的有利基因過表達的第二輪設計的突變體細菌的步驟，從而相對于權利要求2所述的設計的突變體細菌在所述選擇的生長條件下所述突變體細菌表現出改善的存活和/或生長。

7.根據權利要求6所述的方法，包括一個或多個另外輪的誘變并重復實施權利要求1所述的步驟(a)-(c)以提供相對于前一輪的設計的突變體細菌在所述環境挑戰存在下表現出改善的存活和/或生長的第三或更多輪突變體細菌。

8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述不利基因的去除和/或破壞包括基因組最小化。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述基因組最小化包括將質粒DNA整合至細菌染色體中并隨后解離共合體。

10.根據權利要求8所述的方法，其中所述基因組最小化包括在線性DNA末端通過短同源臂介導的同源重組。

11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，進一步包括將至少一種異源基因引入到所述細菌中的步驟。

12.根據權利要求11所述的方法，其中所述異源基因有利于在所述選擇的生長條件下生長和/或存活。

13.根據權利要求11或權利要求12所述的方法，包括將異源基因簇引入到所述細菌中的步驟。

14.根據權利要求13所述的方法，其中所述異源基因簇編碼生物合成路徑。

15.根據權利要求14所述的方法，其中所述生物合成路徑產生次級代謝產物。

16.根據權利要求13所述的方法，其中所述異源基因簇編碼生物降解路徑。

17.根據權利要求11所述的方法，其中所述異源基因編碼治療性蛋白。

18.根據權利要求17所述的方法，其中所述治療性蛋白選自：

(a)酶；

(b)抗體；

(c)抗原；

(d)毒素；

(e)配體結合蛋白；

(f)抗生素；

(g)肽；和

(h)細胞因子。

19.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述選擇的生長條件包括存在以下各項：

(a)環境污染物；

(b)工業廢棄產品；

(c)醫療廢棄產品；

(d)藥物或候選藥物；

(e)選擇的碳源，例如烴；

(f)一種或多種其它生物，例如微生物和病毒。