[發(fā)明專利]小核糖核酸病毒樣顆粒在植物中的產(chǎn)生

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380055096.5
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號: CN104755614B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬克-安德烈·蒂奧斯特;皮埃爾-奧利維耶·拉瓦伊;曼儂·庫特里;露西·鮑林;路易斯-菲利普·維澤納
• 申請（專利權(quán)）人: 莫迪卡戈公司
• 主分類號: C07K14/085
• 分類號: C07K14/085;C07K14/09;C07K14/095;C07K14/10;C12N15/82;C12N15/42;C12N15/41;A61K39/125;A61K39/135;A61P31/14;A61P37/04;C07K16/10
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

提供了在植物中產(chǎn)生小核糖核酸病毒樣顆粒(PVLP)的方法。該方法包括將第一核酸和第二核酸引入植物、植物的部分或植物細胞。第一核酸包含植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)，第一調(diào)節(jié)區(qū)與編碼picornavims多肽的核苷酸序列可操作地連接。第二核酸包含植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)，第二調(diào)節(jié)區(qū)與編碼一種或多種picornavims蛋白酶的核苷酸序列可操作地連接。在允許核酸表達的條件下培養(yǎng)植物、植物的部分或植物細胞，從而產(chǎn)生PVLP。也提供了包含多肽的PVLP。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生小核糖核酸病毒結(jié)構(gòu)蛋白。更具體地，本發(fā)明也涉及在植物中產(chǎn)生包含小核糖核酸病毒結(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒。

發(fā)明背景

小核糖核酸病毒是小的無包膜的正鏈RNA病毒，其可以引起人和動物中多種臨床表現(xiàn)。基于包括序列同源性和酸敏感性的多種性質(zhì)，小核糖核酸病毒被分為多個屬，其中包括多種人和動物的重要病原體。

小核糖核酸病毒具有裸露的核衣殼。衣殼為排列為緊密包裝的二十面體結(jié)構(gòu)的60個原體。每一原體由4個多肽組成，稱為VP(病毒蛋白)1、2、3和4。VP2和VP4多肽起源于被稱為VP0的前體，VP0在病毒基因組RNA內(nèi)化到細胞后被切割。VP4位于衣殼的內(nèi)側(cè)。根據(jù)脫水類型和程度，病毒顆粒直徑為約27-30nm。

小核糖核酸病毒具有7.1-8.9kb的單組分、線性、多聚腺苷酸化的ssRNA(+)基因組，其由編碼多蛋白的單個ORF構(gòu)成。病毒基因組RNA在5’端具有病毒蛋白(VPg)，代替甲基化核苷酸帽結(jié)構(gòu)。5’端長的UTR包含內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。P1區(qū)編碼結(jié)構(gòu)多肽。P2和P3區(qū)編碼與復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白。較短的3’UTR在(-)鏈合成中是重要的。L為存在于一些屬中的額外的N末端前導(dǎo)蛋白，其可以為蛋白酶(口蹄疫病毒，馬鼻病毒)或具有其他的功能(嵴病毒，心臟病毒)。

病毒粒子RNA為感染性的，并且作為基因組和病毒信使RNA。IRES允多種蛋白的直接翻譯。由病毒蛋白酶將多蛋白最初加工為各種前體和成熟蛋白，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白、復(fù)制酶、VPg和多種修飾宿主細胞、最終導(dǎo)致細胞溶解的蛋白。

腸病毒71(EV71)為單鏈RNA病毒的小核糖核酸病毒科的成員。它是無包膜病毒，并且它的衣殼由多個作為單個病毒翻譯產(chǎn)物的片段產(chǎn)生的外殼蛋白組成。圖1(現(xiàn)有技術(shù))中呈現(xiàn)了病毒多蛋白到結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)組分的加工。多蛋白基因的P1區(qū)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，而P2和P3區(qū)編碼病毒的非結(jié)構(gòu)組分。通過病毒蛋白酶2A將結(jié)構(gòu)蛋白前體P1(圖1中的1ABCD)從多蛋白上切割之后，P1前體被加工為衣殼蛋白VP0、VP1(圖1中的1D片段)和VP3(圖1中的1C片段)。3C組分和它的前體3CD(P3區(qū)所編碼)為負責(zé)將P1前體加工為衣殼蛋白的病毒蛋白酶。VP0、VP1和VP3原體同時地組裝為空的衣殼，并且據(jù)信，在空的顆粒組裝后，病毒RNA被包裝到顆粒中。空的衣殼與基因組RNA的結(jié)合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、RNA的內(nèi)化、VP0自動催化切割為VP2(圖1中1B片段)和VP4(圖1中1A片段)，并成熟為穩(wěn)定的150S病毒粒子。通常在小核糖核酸病毒感染期間發(fā)現(xiàn)包含未切割的VP0前體的空的衣殼。

已從P1前體蛋白與3CD蛋白酶的共表達實現(xiàn)昆蟲細胞中EV71VLP的產(chǎn)生(Hu etal.,2003,Biotechnology Letters 25:919-925)。Chung et al.描述了使用單個桿狀病毒載體產(chǎn)生P1和3CD(2008,Vaccine 26:1855-1862)。小鼠中的免疫原性研究顯示，純化的EV71VLP為致死劑量的病毒處理提供了保護。

來自于EV71的VP1蛋白產(chǎn)生于轉(zhuǎn)基因番茄的果實中，并且用含有VP1的轉(zhuǎn)基因果實飼養(yǎng)小鼠導(dǎo)致VP1特異性糞便IgA和血清IgG的發(fā)展(Chen et al.,2006,Vaccine24:2944-2951)。