[發明專利]CRZ1突變型真菌細胞有效
【說明書】：
本發明提供了CRZ1突變型真菌宿主細胞，例如巴斯德畢赤酵母。突變型真菌宿主細胞顯示出溫度抗性、增強的發酵穩健性和增加的異源多肽(例如免疫球蛋白)的表達。使用此類突變型真菌宿主細胞，生產異源多肽(例如免疫球蛋白)的方法在本發明的范圍內。
本申請要求于2012年10月22日提交的美國臨時專利申請號61/716,670的利益；所述美國臨時專利申請整體通過引用并入本文。
發明領域
本發明涉及CRZ1突變體等位基因和包含此類等位基因的真菌宿主細胞，例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，連同其使用方法。
發明背景
GlycoFi已將畢赤酵母工程化以產生具有人樣糖基化的重組糖蛋白。然而，廣泛遺傳修飾也已引起細胞壁結構中的根本變化，使這些經糖工程化的菌株傾向于細胞裂解且降低發酵期間的細胞穩健性。這些不希望的性狀已導致細胞活力的大幅降低以及細胞內蛋白酶泄露到發酵液內的顯著增加，導致重組產物得率和質量兩者的降低。已知缺乏功能性OCH1 (真菌糖基化途徑中的多肽)的分離的真菌宿主細胞，例如白色假絲酵母(Candida albicans)；多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；巴斯德畢赤酵母，是溫度敏感的。例如，白色假絲酵母och1敲除型在42℃下是溫度敏感的(Bates等人，Outer Chain N-Glycans AreRequired for Cell Wall Integrity and Virulence of Candida albicans，TheJournal of Biological Chemistry 281: 90-98(2006)；多形漢遜酵母och1敲除型在45℃下是溫度敏感的(Kim等人，Functional Characterization of the Hansenulapolymorpha HOC1，OCH1，and OCR1 Genes as Members of the Yeast OCH1Mannosyltransferase Family Involved in Protein Glycosylation，The Journal ofBiological Chemistry，281: 6261-6272(2006))；粟酒裂殖酵母och1敲除型在37℃下是溫度敏感的(Yoko-o等人，Schizosaccharomyces pombe och1+ encodes alpha-1,6-mannosyltransferase that is involved in outer chain elongation of N-linkedoligosaccharides，FEBS Letters 489: 75-80(2001))；釀酒酵母och1敲除型在37℃下是溫度敏感的(Nakayama等人，OCH1 encodes a novel membrane boundmannosyltransferase: outer chain elongation of asparagine-linkedoligosaccharides，EMBO J. 11(7):2511-9(1992))；并且巴斯德畢赤酵母och1敲除型在37℃下是溫度敏感的(Choi等人，Use of combinatorial genetic libraries to humanizeN-linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris，Proc Natl Acad Sci U S A.100(9):5022-7(2003))。制備在細胞培養中更穩健的och1-真菌宿主細胞(例如畢赤酵母細胞)的另外遺傳修飾是有價值的。
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