[發明專利]線粒體毒性檢測

在審

• 申請號: 201380052245.2
• 申請日: 2013-10-04
• 公開（公告）號: CN104704361A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 弗雷德里克·舍瓦爾;約翰內斯·埃英格;芒努斯·漢森;埃斯基爾·埃爾梅爾;德里克·格雷戈里·巴徹勒
• 申請（專利權）人: 紐維制藥有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;宮傳芝

技術領域

本發明提供了用于藥物篩選的新方法。特別地，該方法對于檢測物質對線粒體的作用，尤其是藥物物質或候選藥物物質的毒性或有益作用是有用的。該方法是基于體外活的人線粒體中的測量，但是在盡可能接近體內狀態的環境中。該方法還可用于檢測物質對線粒體呼吸的影響。

背景技術

在藥物開發中，難以估計當在人體中使用時，藥物是否會影響產生能量的線粒體。由于如心臟或肝毒性作用，近年來由FDA批準的多種新藥隨后被撤回。因此，在1994年和2006年之間由FDA登記的新藥中，38種藥物均由于對肝和心臟的毒性作用被撤回，這是線粒體毒性的典型癥狀。顯然，這些新藥通過了批準以前進行的標準毒性檢測，并且在用藥物治療了大量患者之后才觀察到毒性作用。Dykens&Will(2007)指出，有證據表明，線粒體功能障礙在從市場上撤回的以及再次引入的具有嚴格限制的多種藥物物質的毒性中起作用。

此外，在近幾年，線粒體功能已經引起了很大的興趣，并且通常認為線粒體功能障礙對于大量疾病的發病機制(例如肌肉疾病、神經病變、心肌病、腦病、敗血癥引起的多臟器功能衰竭)是起作用的因素。

目前，藥物候選物的線粒體毒性大部分是在動物和細胞培養物中進行評價，其結果難以轉化為未來的人類應用。

因此，存在對于開發用于線粒體毒性的檢測(其是敏感的、可重復的、可靠的和容易的，并且其可以用于藥物開發的檢測)的需要。

發明內容

本發明涉及涉及含有線粒體的人血液成分的方法。開發的方法的優點是體外測量活的人線粒體中的藥物毒性(或有益的影響)，但是在盡可能接近體內的環境中。研究了血漿(這提供與體內環境非常接近的關聯)中含線粒體的的人血液成分(白血細胞和/或血小板)。因此，所有的緩沖能力、血清白蛋白、電解質、水解酶等在測量期間存在。

該新穎的方法將直接導致人體中真實的毒性血液濃度的評估，這在作為當前使用方法的細胞培養和動物研究中是不可能的。因此，在相比現在顯著更早的階段檢測和篩選候選藥物物質的人類毒性是可能的。反過來，這將允許在更早的階段排除有毒的候選藥物，從而避免許多動物試驗以及將來人的痛苦。這將促進在早期階段選擇候選藥物物質，從而降低藥物開發的總的時間和成本。

取決于試驗的目的，該方法可用于具有不同的設定的不同環境。

因此，根據本發明的方法可用于以下各項，而不將范圍限制于此：

1.篩選并選擇來自健康個體血液或所謂的血沉棕黃層(buffy?coat)(其是血小板和白血細胞的濃縮溶液)的細胞中的早期或晚期階段的候選藥物。

2.檢測患者對于已知的線粒體毒物(mitochondrial?toxicant)的敏感性。

3.在臨床試驗中分析線粒體藥物毒性。

4.分析預期改善線粒體功能的藥物的有益作用。

一種合適的用于篩選和選擇候選藥物或檢測人對作用于線粒體的物質的敏感性(即，上面的項目1和2)的方法是包括以下(步驟)：

i)使分離自人血液樣品的含有活線粒體(live?mitochondria)的細胞樣品進行高分辨率呼吸測量(high-resolution?respirometry)

ii)使細胞樣品與提高線粒體內膜對質子的滲透性的物質接觸，

ⅲ)加入包含介質(載體、媒介物，vehicle)中的檢測物質的檢測樣品，

ⅳ)比較加入檢測樣品之前和之后的耗氧量(氧消耗)并且比較檢測樣品耗氧量與介質的對照樣品的耗氧量，其中，耗氧量下降表明對線粒體的負面作用，

v)使來自iii)的樣品與線粒體復合物I-功能抑制劑，如魚藤酮接觸，以表明依賴于復合物II-底物氧化的細胞呼吸，

和

vi)使來自v)的樣品與線粒體復合物III-功能抑制劑，如抗霉素A接觸以測定任何非線粒體耗氧活性，如所述樣品的自動氧化(auto-oxidation)。

用于篩選和選擇潛在的候選藥物或用于檢測人對具有線粒體作用的物質的靈敏性(即，上面的項目1和2)的替代方案，是研究這類檢測物質在復合物II篩選試驗中的效果。在圖11中示出了這種方法，并且包括：

i)使分離自人血液樣品的含有活線粒體的細胞樣品進行高分辨率呼吸測量，

ⅱ)使細胞樣品與抑制復合物I呼吸的物質接觸，

ⅲ)加入包含介質中的檢測物質的檢測樣品，

ⅳ)加入使質膜透化(permeabilize)的物質，

ⅴ)將參比物質加入至iv)中得到的樣品，以及