[發明專利]線粒體毒性檢測

在審

• 申請號: 201380052245.2
• 申請日: 2013-10-04
• 公開（公告）號: CN104704361A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 弗雷德里克·舍瓦爾;約翰內斯·埃英格;芒努斯·漢森;埃斯基爾·埃爾梅爾;德里克·格雷戈里·巴徹勒
• 申請（專利權）人: 紐維制藥有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;宮傳芝

1.一種方法，包括：

i)使分離自人血液樣品的含有活線粒體的細胞樣品進行高分辨率呼吸測量，

ii)使所述細胞樣品與提高線粒體內膜對質子的滲透性的物質接觸，

iii)加入包含介質中的檢測物質的檢測樣品，

iv)比較加入所述檢測樣品之前和之后的耗氧量并且比較所述檢測樣品的耗氧量與所述介質的對照樣品的耗氧量，其中，所述耗氧量下降表明對所述線粒體的負面作用，

v)使來自iii)的樣品與線粒體復合物I-功能抑制劑接觸，

和

vi)使來自v)的樣品與線粒體復合物III-功能抑制劑接觸。

2.一種方法，包括：

i)使分離自人血液樣品的含有活線粒體的細胞樣品進行高分辨率呼吸測量，其中，所述細胞樣品來自進行臨床研究或進行治療方案的個體，

ii)使所述細胞樣品與提高線粒體內膜對質子的滲透性的物質接觸，

iii)比較來自進行臨床研究或治療方案的所述個體的樣品的耗氧量與對照樣品的耗氧量，其中，耗氧量下降表明對所述線粒體的負面作用，

iv)使來自iii)的所述樣品與線粒體復合物I-功能抑制劑接觸，

和

v)使來自iv)的所述樣品與線粒體復合物III-功能抑制劑接觸。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，在37℃的恒定溫度下，在400-25μM?O₂范圍的氧濃度下進行所述高分辨率呼吸測量。

4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，加入提高線粒體內膜對質子的滲透性的物質以獲得存在于所述樣品中的線粒體的電子傳遞系統的最大容量。

5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，提高線粒體內膜對質子的滲透性的所述物質選自羰基氰對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)、羰基氰間-氯苯腙(CCCP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)和其他質子載體、和它們的混合物。

6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，以0.1至10μM，如0.5至5μM、1至3μM或約2μM范圍的濃度加入提高線粒體內膜對質子的滲透性的所述物質。

7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，提高線粒體內膜對質子的滲透性的所述物質是FCCP。

8.根據權利要求1、3至6中任一項所述的方法，其中，所述介質是有機溶劑，如，例如乙醇、異丙醇、甲醇、DMSO(二甲基亞砜)、DMF(二甲基甲酰胺)或DMA(二甲基乙酰胺)。

9.根據權利要求1、3至8中任一項所述的方法，其中，所述檢測樣品是液體形式并且所述檢測樣品包含已知濃度的所述檢測物質。

10.根據權利要求9所述的方法，其中，以逐漸升高的濃度加入所述檢測樣品。

11.根據權利要求10所述的方法，其中，逐步加入檢測樣品導致所述檢測樣品的終濃度為1μM至10mM。

12.根據權利要求1、3至11中任一項所述的方法，其中，iii)中的所述對照樣品與所述檢測樣品相同，但不具有檢測樣品的內含物。

13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，加入所述線粒體復合物I-功能抑制劑以表明依賴于復合物II底物氧化的細胞呼吸。

14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，以0.1至10μM，如0.5至5μM、1至3μM或約2μM范圍的濃度加入所述線粒體復合物I-功能抑制劑。

15.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述線粒體復合物I-功能抑制劑是魚藤酮。

16.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，加入所述線粒體復合物III-功能抑制劑以測定任何非線粒體耗氧活性，如所述樣品的自動氧化，

17.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，以約0.1至10μg/ml，如約0.5至5μg/ml、約0.75至2μg/ml或1μg/ml的終濃度加入所述線粒體復合物III-功能抑制劑。

18.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述線粒體復合物III-功能抑制劑是抗霉素A。