[發明專利]3-差向異構酶

在審

• 申請號: 201380050744.8
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN104903457A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: R·D·伍德耶爾;R·W·阿門特勞特
• 申請（專利權）人: 泰特&萊爾組分美國公司;塔特和萊利技術有限公司
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12P19/24;C12N9/90
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 嚴政;李婉婉

技術領域

本發明涉及一種具有酮糖-3-差向異構酶活性的蛋白，以及一種編碼所述蛋白的核酸分子。本發明還涉及一種載體和一種含所述核酸分子的宿主細胞。本發明還涉及一種用所述蛋白合成阿洛酮糖的方法，以及按這種方式制造的阿洛酮糖。

背景技術

阿洛酮糖是一種“零熱量”甜味劑，并有認為與葡萄糖類似的甜度。其還具有類似于其他醣類的填充和褐變屬性。阿洛酮糖的主要目標市場是食品和飲料制造商，在其產品中，目前所用為葡萄糖、果糖或高果糖漿，而且正尋求顯著減少熱量卻不顯著改變糖成分所賦予的其他屬性，如：填充作用、褐變、質地和甜度。

在美國，阿洛酮糖并非通常認為是安全(GRAS)的物質，但目前有一項待定的GRAS通知(GRN400)。阿洛酮糖存在于加工甘蔗和甜菜糖蜜、經蒸汽處理的咖啡、小麥植物產品和高果糖玉米糖漿。阿洛酮糖的典型日總攝入量估計為每天0.2克以上。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向異構體，而阿洛酮糖和果糖結構的差異使得阿洛酮糖不能被人體代謝，因而其熱量為零。由于阿洛酮糖不含熱量，因此，認為其是一種有前途的候選甜味填充劑，而且，據稱在具有甜味的同時還能保持與典型單糖相似的性質。

酮糖-3-差向異構酶可使果糖和阿洛酮糖互相轉化。號為8030035的美國專利和公布號為WO2011/040708的PCT公開了可將來自農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)并具阿洛酮糖-3-差向異構酶活性的蛋白與D-果糖反應，從而制造D-阿洛酮糖(阿洛酮糖的另一名稱)。

公開號為2011/0275138的美國專利公開了一種來自根瘤菌屬(Rhizobium?genus)微生物的酮糖-3-差向異構酶。此蛋白對D或L-戊酮糖和D或L-己酮糖，特別是D-果糖和D-阿洛酮糖表現出了很高的特異性。該文件還公開了一種使用蛋白制造酮糖的方法。

號為100832339的韓國專利公開了一種中華根瘤菌(Sinorhizobium)YB-58菌株，該菌株能夠將果糖轉化成阿洛酮糖，并公開了一種用中華根瘤菌YB-58菌株的真菌體制造阿洛酮糖的方法。

號為1020090098938的韓國專利申請公開了一種用大腸桿菌制造阿洛酮糖的方法，其中，大腸桿菌是表達一種編碼阿洛酮糖-3異構酶的多核苷酸。

本發明的目的是改進阿洛酮糖的現有制備技術。本發明的目的是提供一種酮糖-3-差向異構酶，其在全細胞系統中的轉化率和體積產率高于之前報導的。

發明內容

本發明源于對三種酮糖-3-差向異構酶的鑒別及表征，其示例性氨基酸序列分別示于編號2、4和6的序列。可用該酮糖-3-差向異構酶將果糖轉化成阿洛酮糖。之前已將這些蛋白確定為假想蛋白，或確定為具有塔格糖異構酶活性。然而，本發明人現驚奇地發現這些酶有阿洛酮糖-3-差向異構酶活性。

本發明的第一方面提供一種含多肽序列的蛋白，該序列與編號2的序列、編號4的序列或編號6的序列有至少70％的序列同一性，其特征在于，所述蛋白具有酮糖-3-差向異構酶活性。

方便而言，該多肽序列與編號2的序列，編號4的序列或編號6的序列有至少80％、90％、95％或99％的序列同一性，或有100％的序列同一性。

優選地，該多肽序列含編號13的序列。

優選地，該蛋白固定于固體基質。

本發明的第二方面提供一種本發明第一方面的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。

本發明的第三方面提供一種核酸分子，該核酸分子包含編碼本發明第一方面所述蛋白的多核苷酸序列。

優選地，該核酸分子包含多核苷酸序列，其中：

i)該多核苷酸序列與編號5、編號1或編號3的序列有至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性，或是100％的序列同一性；或

ii)該多核苷酸序列在高度嚴謹條件下雜交得到一種多核苷酸，該多核苷酸具有與編號5、編號1或編號3所示序列互補的序列。

本發明的第四方面提供一種載體，其特征在于載體包含本發明第三方面所述的核酸分子。

本發明的第五方面提供一種宿主細胞，其特征在于宿主細胞包含本發明第三方面所述的重組核酸分子。

方便而言，該宿主細胞是一種酵母、細菌或其他微生物，或一種哺乳動物、植物或其他細胞的培養物。

優選地，該宿主細胞為大腸桿菌。

本發明的第六方面提供一種由本發明第一方面所述蛋白制造的阿洛酮糖。