[發(fā)明專利]使用必需基因作為標記并任選地將其再循環(huán)的細胞修飾方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380048215.4
• 申請日: 2013-09-19
• 公開（公告）號: CN104640990B
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設計）人: 艾瑟·蘭格·德;伯納德·邁瑞克;約翰尼斯·安德列什·勞博斯;黃秀倫
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產(chǎn)權資產(chǎn)管理有限公司
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/80
• 代理公司: 北京東方億思知識產(chǎn)權代理有限責任公司11258
• 代理人: 肖善強

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及用于在靶位點修飾宿主細胞的方法。本發(fā)明還涉及通過這種方法能夠得到的宿主細胞。本發(fā)明還涉及使用根據(jù)本發(fā)明被修飾的帶有目的核酸的細胞來生產(chǎn)目的生物化合物的方法。

發(fā)明背景

微生物(例如真菌或酵母)的轉化是增強、引入或改變特定性狀的公知程序。為了這個目的，可以使用外源和內(nèi)源DNA序列二者。因為轉化并非100％有效，因此使用標記基因來選擇被轉化菌株，即含有期望性狀的個體。標記基因是被引入DNA的一部分，其賦予被轉化菌株可被選擇的新的屬性。普遍使用的標記的實例是抗生素或其它有毒化合物抗性基因、解除營養(yǎng)缺陷的基因或參與某化合物的代謝的基因。

使用標記基因的成功率不同。阻礙成功的因素包括：1)真正被轉化的菌株消耗來源于培養(yǎng)基的抗生素/有毒化合物，從而允許未被轉化的菌株生長；和2)必需成分的互養(yǎng)(cross-feeding)。這些因素引起背景生長，因此需要多輪純化以獲得純的被轉化菌株。這個過程可以是耗時的。此外，對于某些種類的選擇標記(例如營養(yǎng)缺陷型標記或參與代謝的標記)，必須使用限定培養(yǎng)基來選擇被轉化菌株。與非限定生長培養(yǎng)基相比，這些限定培養(yǎng)基常常減緩生長。

真菌常常顯示多核，這阻礙選擇其中所有核具有相同基因型的細胞。這要求多輪選擇，經(jīng)常經(jīng)由孢子形成期以鑒定單核區(qū)(single-nuclei stadia)，這是耗時的。

此外，通常需要從菌株中移除標記基因以用于商業(yè)發(fā)酵。這種移除可導致意料之外的基因型和/或表型效果。

當以微量滴定板方式進行高通量(HTP)轉化時，背景生長的最小化變得甚至更加困難。適用于這個目的的標記較少，而且由于微孔中的有限生長區(qū)域，選擇劑的消耗或互養(yǎng)是常見的。通常地，應用選擇平板，但自動化可受益于在液體培養(yǎng)基中選擇，而這在選擇劑的消耗或互養(yǎng)發(fā)生時是不可能的。

因此，這些作用嚴重阻礙了HTP轉化的效率。

發(fā)明簡述

本發(fā)明涉及修飾生物體的方法。該方法可被用于，例如敲除基因或者向生物體中轉移任何期望的一種或多種核酸。換言之，該方法可被用作轉化生物體的方法。

本發(fā)明基于必需基因(essential gene)的使用，必需基因即具有以下功能或編碼以下功能的一種或多種核酸，即沒有所述功能的個體細胞無法生存或可不分裂(在細胞被暴露的特定條件下)。這種基因可被用于通過必需功能的回補(complementation)進行選擇。這種基因的使用確保僅存活菌株是含有回補的必需功能的那些，因此背景生長被減輕。

本文中，具有以下功能或編碼以下功能的一種或多種核酸可被稱為必需核酸，即沒有所述功能的個體細胞無法生存或可不分裂/復制(在細胞被暴露的特定條件下)。必需核酸可以是單一核酸。然而，可以以下述方式實施本發(fā)明，其中兩種或更多種核酸合起來具有或編碼必需功能。

為了能夠使用必需基因作為選擇標記，通常首先使這個基因在宿主基因組中失活，即致使其無功能，例如通過缺失。存在一些敲除必需基因表達的方法，例如利用siRNA沉默、抑制啟動子活性、形成突變、從染色體中部分或完全移除或者重排必需基因DNA。在本發(fā)明中，通常使用不同的方法來敲除必需基因。

特別地，用被選擇的必需基因的精確拷貝或其變體，或者用一個或多個基因來完全或部分替換被選擇的必需基因，其中所述一個或多個基因合起來可替換由被替換基因編碼的必需功能。

這種替換(必需)基因與位點特異性重組位點一起被提供，其中所述位點特異性重組位點能夠被重組酶(例如酪氨酸重組酶，例如Cre-重組酶)識別。替換(必需基因)可位于兩個位點特異性重組位點之間。

編碼重組酶的核酸也可通過質粒被提供，例如位于相同重組位點之間(以使它將在重組酶的誘導和表達之后被缺失)或者位于基因組的其它地方，或通過瞬時表達被提供。

重組酶編碼核酸可受誘導型啟動子的控制而表達，因此啟動子被誘導之后，重組酶產(chǎn)生。

重組酶被選擇以使它能夠識別位點特異性重組位點，且位點特異性重組位點被放置以使，在重組酶存在時，重組發(fā)生從而使“替換”必需基因變得無功能。位點特異性重組位點通常將位于替換必需基因的兩個位點(即“上游”和“下游”)以使替換必需基因被整體缺失(在重組酶存在時)。