[發明專利]使用必需基因作為標記并任選地將其再循環的細胞修飾方法

有效

• 申請號: 201380048215.4
• 申請日: 2013-09-19
• 公開（公告）號: CN104640990B
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 艾瑟·蘭格·德;伯納德·邁瑞克;約翰尼斯·安德列什·勞博斯;黃秀倫
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/80
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司11258
• 代理人: 肖善強

1.在靶位點修飾宿主細胞的方法，所述方法包括：

通過用其側翼是至少兩個位點特異性重組位點的具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的核酸的拷貝替換宿主細胞中具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的內源核酸的步驟提供宿主細胞，所述宿主細胞在第一位點包含至少兩個位點特異性重組位點和具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的核酸，其中在所述第一位點，至少兩個所述位點特異性重組位點位于具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的所述核酸的側翼；

在靶位點向所述宿主細胞中引入具有所述必需功能或編碼具有所述必需功能的產物的另一核酸；以及

通過所述至少兩個位點特異性重組位點在所述第一位點實施重組，以使所述第一位點處具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的所述核酸無功能，

其中目的核酸被引入到靶位點，

從而在所述靶位點修飾所述宿主細胞。

2.根據權利要求1的方法，其中在所述靶位點向所述宿主細胞中引入具有所述必需功能或編碼具有所述必需功能的產物的所述另一核酸導致所述靶位點的核酸序列丟失。

3.根據權利要求1的方法，其中至少兩個所述位點特異性重組位點位于編碼重組酶的序列的側翼，其中所述重組酶識別至少兩個所述位點特異性重組位點。

4.根據權利要求1的方法，其中所述重組酶是酪氨酸重組酶。

5.根據權利要求3的方法，其中所述重組酶的表達受誘導型啟動子的控制。

6.根據權利要求1的方法，其中所述必需功能是真菌中的必需功能。

7.根據權利要求1的方法，其中同時、分別或順次地實施以下：

在靶位點向所述宿主細胞中引入具有所述必需功能或編碼具有所述必需功能的產物的另一核酸；和

通過所述至少兩個位點特異性重組位點在所述第一位點實施重組，以使具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的所述核酸無功能。

8.根據權利要求1的方法，其中所述必需核酸的另一拷貝和至少兩個位點特異性重組位點一起被引入到所述靶位點。

9.根據權利要求8的方法，其還包括：

在第二靶位點向所述宿主細胞中引入具有所述必需功能或編碼具有所述必需功能的產物的所述核酸的另一拷貝，所述序列任選地和至少兩個位點特異性重組位點一起被引入；和

通過所述至少兩個位點特異性重組位點在第一靶位點實施重組，以使具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的所述核酸無功能。

10.根據權利要求9的方法，其包括一個或更多個另外的下述循環：

在另外的靶位點向所述宿主細胞中引入具有所述必需功能或編碼具有所述必需功能的產物的所述核酸的另一拷貝，所述序列任選地和至少兩個位點特異性重組位點一起被引入；和

通過必需基因側翼的所述至少兩個位點特異性重組位點的重組使在之前的引入循環中引入的具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的所述核酸無功能。

11.根據權利要求1的方法，其中所述宿主細胞的同源重組(HR)效率提高。

12.根據權利要求1的方法，其在液體基質中實施。

13.根據權利要求1的方法，其中所述目的核酸編碼目的生物化合物或參與合成目的生物化合物的化合物。

14.用目的核酸轉化宿主細胞的方法，所述方法包括：

通過用其側翼是至少兩個位點特異性重組位點的具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的核酸的拷貝替換宿主細胞中具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的內源核酸的步驟提供宿主細胞，所述宿主細胞在第一位點包含位于具有必需功能或編碼具有必需功能的產物的核酸側翼的至少兩個位點特異性重組位點；

在第二位點向所述宿主細胞中引入目的核酸和具有所述必需功能或編碼具有所述必需功能的產物的另一核酸；和

通過所述至少兩個位點特異性重組位點的重組移除位于所述第一位點的具有所述必需功能或編碼具有所述必需功能的產物的所述核酸，

從而用目的核酸轉化所述宿主細胞。

15.根據權利要求1的方法，其中所述細胞是原核、古細菌或真核細胞。

16.根據權利要求1的方法，其中所述宿主細胞是真菌細胞。