[發明專利]外膜囊泡

有效

• 申請號: 201380045396.5
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN104602702B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: G·格蘭迪;I·馬格里特伊若斯;E·恰洛特
• 申請（專利權）人: 葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 彭昶

本發明提供了來自革蘭氏陰性細菌的外膜囊泡(OMV)，該OMV包含在其腔中游離的至少一種異源蛋白，其中當給予哺乳動物時，該OMV能夠引發針對該異源蛋白的免疫應答。本發明還提供了用于制備本發明的OMV的方法，包含本發明的OMV的藥物組合物，尤其是免疫原性組合物和疫苗，以及使用OMV在哺乳動物中產生抗體免疫應答的方法。

本申請請求2012年9月18日提交的美國臨時申請US61/702,296和2013年3月15日提交的美國臨時申請US61/799,311的權益，這兩項申請的全部內容通過引用納入本文用于所有目的。

技術領域

本發明涉及來自革蘭氏陰性細菌的囊泡。囊泡包含存在其腔中的異源蛋白。該囊泡特別有用于免疫原性組合物，例如疫苗。

背景技術

由于細胞被膜的膨壓，革蘭氏陰性菌可在其生長期間自發釋放外膜囊泡(OMV)?？赏ㄟ^某些細菌組分的破壞來促進這類OMV的形成，例參考文獻1和2中破壞了大腸桿菌Tol-Pal系統以得到在生長期間向培養基釋放囊泡的菌株。也可通過破壞完整的細菌來產生OMV。已知的OMV生產方法包括使用去污劑處理(例如，用脫氧膽酸鹽)[3和4]，無去污劑方法[5]或聲處理[6]等的方法。

OMV在免疫原性細胞表面相關的、周質和分泌的抗原中富集，并且已經用作例如針對腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清組B的疫苗[7]。它們特別適于該用途，因為囊泡含有發揮佐劑作用的化合物，這引發針對該抗原的強免疫應答。從而對于免疫系統而言，囊泡是比純化的抗原性蛋白質或其他細菌組分更為接近的天然細菌模擬物。OMV因此保持疫苗和其他免疫原性組合物的更具吸引力的靶標。已經提出，通過使用ClyA作為融合伙伴對OMV進行工程改造以在OMV表面上呈現多種抗原能夠增加一些蛋白質抗原的免疫原性[8]。

已經進行了多次嘗試以使異源蛋白，尤其是異源抗原靶向OMV。然而，很大程度上因為與異源蛋白質向囊泡運輸相關聯的挑戰，迄今為止，相對親本細菌而言外來的抗原仍然在大部分OMV中顯著缺失[11]。大多數使異源蛋白靶向OMV的嘗試依賴于異源蛋白與整合膜蛋白的共價連接。這類共價連接的異源蛋白的示例包括FLAG表位與OmpA(外膜蛋白A)的全長序列的融合物、FLAG表位與PagP(PhoPQ-激活基因P)的全長序列的融合物[9]以及GFP與ClyA(溶細胞素)的融合物[10]。憑借它們與膜蛋白的共價連接，所得的融合蛋白靶向外膜并且因此包含于OMV中。這些方法具有缺陷，尤其是由于難以在不對轉化的細菌造成有害影響的情況下過表達大量的整合膜蛋白。

還已證明，難以使周質蛋白靶向OMV。GFP與Tat(雙精氨酸轉運體)信號序列的融合導致靶向周質的GFP的過表達，但是GFP熒光幾乎沒有超過OMV中的背景熒光水平[11]，表明GFP沒有進入OMV中或者由于錯誤折疊而在OMV中沒有功能。

仍然存在對開發適于在OMV中表達異源蛋白的方法，尤其是在OMV中表達抗原性蛋白質的方法的需求。也仍然存在對替代或改良的OMV(尤其用于疫苗)的需求。

發明內容

發明人已經發現使異源蛋白靶向OMV的腔克服了許多與使異源蛋白靶向OMV的膜相關的問題。令人驚訝地，發明人也已經發現當給予哺乳動物時，腔中含異源蛋白的OMV能夠引發針對該蛋白質的免疫應答。

因此，本發明提供了來自革蘭氏陰性細菌的外膜囊泡(OMV)，其中該OMV包含在其腔中游離的至少一種異源蛋白，并且當給予哺乳動物時，該OMV能夠引發針對該異源蛋白的免疫應答。

本發明也提供了制備本發明的OMV的方法，該方法包括在革蘭氏陰性細菌的周質中表達異源蛋白的步驟。本發明還提供通過該方法獲得的或可通過該方法獲得的OMV。

本發明也提供包括(a)本發明的OMV和(b)藥學上可接受的運載體的藥物組合物。