[發明專利]使用序列標簽的序列確定方法

無效

• 申請號: 201380042163.X
• 申請日: 2013-06-11
• 公開（公告）號: CN104520443A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發明（設計）人: 馬利克·法哈姆;馬丁·穆爾黑德;托馬斯·威利斯;建標·鄭
• 申請（專利權）人: 賽昆塔公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 王思琪;鄭霞

交叉引用

本申請要求2013年3月15日申請的美國專利申請序列號13/835,093的優先權，美國專利申請序列號13/835,093要求以下美國臨時專利申請的優先權：2012年6月11日申請的序列號61/658,317、2012年12月17日申請的序列號61/738,277以及2013年3月11日申請的序列號61/776,647，它們每個的全文通過引用并入本文。本申請還要求全文通過引用并入本文的2013年5月30日申請的美國臨時專利申請序列號61/829,054的優先權。

發明背景

生物或醫學樣品的分析通常需要確定DNA和/或RNA的大的和復雜的群體的核酸序列，例如Gloor等，PLoS?ONE?5(10)：el5406(2010)；Petrosino等，Clinical?Chemistry,55(5):856-866(2009)；Arstila等，Science,286:958-961(1999)。尤其地，編碼免疫分子，例如T細胞或B細胞受體或它們的組分的核酸譜包含大量的關于有機體的健康或疾病狀態的信息，使得已經提出使用這樣的譜作為許多健康狀況的診斷或預后指標，例如Faham和Willis，美國專利公開2010/0151471；Freeman等，Genome?Research,19：1817-1824(2009)；Boyd等，Sci.Transl.Med.,1(12):12ra23(2009)；He等，Oncotarget(2011年3月8日)。這樣的基于序列的譜能夠比基于擴增的靶核酸的大小分布、通過微陣列的序列取樣、來自PCR擴增子的雜交動力曲線的方法或其它方法靈敏得多，例如Morley等，美國專利5,418,134；van?Dongen等，Leukemia,17:2257-2317(2003)；Ogle等，Nucleic?Acids?Research,31:el39(2003)；Wang等，BMC?Genomics,8:329(2007)；Baum等，Nature?Methods,3(11):895-901(2006)。然而，因為待分析的群體的大小、這樣的群體中序列的相似性、序列之間天然變異的有限可預測性以及由許多樣品制備和測量步驟引入數據的噪音，從序列數據有效確定克隆型(clonotype)和克隆型譜(clonotype?profile)構成挑戰，例如Warren等，Genome?Research,21(5):790-797(2011)。

序列標簽或條形碼已經以多種方式用于輔助核酸群體的分析，包括標記、污染監測、罕見突變檢測、物理排序、分子計數等，例如Kinde等，Proc.Natl.Acad.Sci.,108(23):9530-9535(2011)；Casbon等,美國專利公開2012/0071331；Brenner,美國專利5,635,400；Brenner和Macevicz，美國專利7,537,897；Brenner等，Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-1670(2000)；Church等，歐洲專利公開0?303?459；Shoemaker等，Nature?Genetics,14:450-456(1996)；Morris等，歐洲專利公開0799897A1；Wallace,美國專利5,981,179。最近，Kinde等(以上引用)顯示了序列標簽如何能用于區分測序和擴增錯誤與參照序列中的罕見突變。

考慮到用于醫療和診斷應用的準確測序的重要性，如果序列標簽的使用可以就提高序列確定的效率和準確性而在這類應用中擴展，那么它將高度有益。

發明概述

本發明涉及用于產生復雜的核酸群體的基于序列的譜的方法，所述復雜的核酸群體特別是編碼免疫分子或其部分的組庫(repertoire)的重組核酸群體。在許多實施方式和應用中示例了本發明，它們的一些總結于以下并遍及說明書中。

在一個方面，本發明涉及確定免疫組庫的克隆型的方法，所述方法包括步驟：(a)從個體獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品；(b)將序列標簽附接到T細胞受體基因或者T細胞和/或B細胞的免疫球蛋白基因的重組核酸的分子，以形成標簽-分子軛合物，其中所述標簽-分子軛合物的基本上每個分子具有獨特的序列標簽；(c)擴增所述標簽-分子軛合物；(d)測序所述標簽-分子軛合物；以及(e)比對相似序列標簽的序列讀段(read)以確定相應于所述組庫的相同克隆型的序列讀段。