[發(fā)明專利]藥物遞送蛋白質(zhì)的增強(qiáng)運(yùn)輸?shù)耐蛔凅w的分離

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380041215.1
• 申請日: 2013-08-02
• 公開（公告）號: CN104619839A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 拉里·K·梅迪納-考維
• 申請（專利權(quán)）人: 西塞醫(yī)療中心
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00
• 代理公司: 北京銀龍知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶;於毓楨

政府權(quán)利

本發(fā)明在國立衛(wèi)生研究院(National?Institutes?of?Health)頒發(fā)的資助編號CA129822和CA140995的政府支持下完成。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了用于細(xì)胞滲透功能以改善藥物向特定細(xì)胞器的遞送的方法和組合物。

背景技術(shù)

定向進(jìn)化已經(jīng)被用于產(chǎn)生具有新趨性、減少的非特異性遞送以及免疫逃逸的假型腺聯(lián)病毒(AAV)衣殼(Kwon和Schaffer，2008；Maheshri等，2006)。不同選擇壓力下的體外和體內(nèi)的噬菌體展示和全病毒文庫的生物淘選產(chǎn)生了具有期望特性的蛋白，比如具有增強(qiáng)的配體結(jié)合和攝入、免疫相互作用或酶活性(Yuan等，2005)。因此，對于用于產(chǎn)生具有改善特征的新蛋白質(zhì)變體的合理突變來說，該方法可能是有力的和更有效的替代方案。該方法的最新開發(fā)的方式采用易錯PCR和交錯延伸來產(chǎn)生變體文庫，該變體文庫可針對不同的細(xì)胞類型進(jìn)行篩選，以挑選出細(xì)胞特異性靶向的載體(Zhao等，1998)。迄今為止，尚未開發(fā)出分離具有增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸功能的蛋白質(zhì)變體的方法。本發(fā)明提出了一種新程序，以及從該程序產(chǎn)生的具有增強(qiáng)的用于藥物遞送的細(xì)胞滲透功能的新蛋白質(zhì)分子。

發(fā)明內(nèi)容

各種實(shí)施方式包括一種增強(qiáng)運(yùn)輸至細(xì)胞的方法，包括：提供組合物，該組合物包括具有增強(qiáng)進(jìn)入至細(xì)胞的一個或多個突變的五鄰體基質(zhì)(PB)蛋白；以及將有效劑量的組合物施用至細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，一個或多個突變是111C和/或333F。在另一實(shí)施方式中，組合物靶向至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核。在另一實(shí)施方式中，組合物進(jìn)一步包括治療性藥物。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，一個或多個突變是SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12、SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15、SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17、SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19和/或SEQ?ID?NO：20。

其他實(shí)施方式包括生產(chǎn)靶向至細(xì)胞器的藥物遞送分子的方法。該方法包括下述步驟：a)獲得編碼五鄰體基質(zhì)(PB)基因的多核苷酸，并產(chǎn)生多核苷酸的突變體；b)將突變的多核苷酸克隆至噬菌體載體，并產(chǎn)生包括噬菌體載體的噬菌體文庫；c)用噬菌體文庫轉(zhuǎn)化細(xì)胞；d)分級分離前述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞收獲細(xì)胞器；e)擴(kuò)增來自前述收獲的細(xì)胞器的噬菌體；f)用擴(kuò)增后的來自前述收獲的細(xì)胞器的噬菌體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；g)重復(fù)步驟(d)、(e)、(f)和(g)；h)滴定來自每輪的前述收獲的細(xì)胞器的噬菌體；i)選擇具有最高滴度的噬菌體，并從噬菌體獲得突變的多核苷酸的序列；以及j)產(chǎn)生由前述序列編碼的多肽，其中該多肽是靶向至細(xì)胞器的藥物遞送分子。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞器選自由線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、核糖體、質(zhì)膜和胞質(zhì)溶膠所組合的組。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞或非哺乳動物細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，使用下述的任何一種或多種產(chǎn)生突變體：基于PCR的方法、化學(xué)誘變、紫外線誘導(dǎo)的誘變或其組合。在另一實(shí)施方式中，藥物遞送分子包括靶向結(jié)構(gòu)域、核內(nèi)體裂解配體結(jié)構(gòu)域和帶正電荷的結(jié)構(gòu)域。

其他實(shí)施方式包括一種用于將治療劑遞送至細(xì)胞器的載體，所述載體包括由增強(qiáng)進(jìn)入至細(xì)胞的一個或多個五鄰體基質(zhì)(PB)突變編碼的多肽。在另一實(shí)施方式中，一個或多個五鄰體基質(zhì)(PB)突變包括111C和/或333F。在另一實(shí)施方式中，載體進(jìn)一步包括聚賴氨酸模體。在另一實(shí)施方式中，載體進(jìn)一步包括調(diào)蛋白的靶向結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方式中，一個或多個PB突變包括C-末端缺失。

其他實(shí)施方式包括一種治療劑，該治療劑包括載體和治療性藥物，所述載體用于將治療劑遞送至細(xì)胞器，所述載體包括由增強(qiáng)進(jìn)入至細(xì)胞的一個或多個五鄰體基質(zhì)(PB)突變編碼的多肽。在另一實(shí)施方式中，治療性藥物是化學(xué)治療劑。