[發(fā)明專利]人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒的高效提純方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380040425.9
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN104507956B
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金洪珍;金亨真
• 申請（專利權(quán)）人: 普瓦絲株式會社
• 主分類號: C07K1/16
• 分類號: C07K1/16;C07K14/025
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11467
• 代理人: 王金雙

本發(fā)明公開了一種人乳頭瘤病毒（HPV）L1蛋白的高純度和高效提純方法。根據(jù)所述提純方法，當(dāng)利用還原劑處理細(xì)胞勻漿而形成加熱/冷卻的時候，所提純的HPV L1蛋白的純度和產(chǎn)率大大地提高。此外，通過所述提純方法提純的HPV L1蛋白的VLP具有極佳的抗原性和免疫原性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有極佳的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特性的人乳頭瘤病毒(HPV)的病毒樣顆粒(VLP)的高效提純方法。

背景技術(shù)

HPV為引起約100％宮頸癌的病原體[1]。據(jù)報道，全世界每年有500,000位女性被診斷患有宮頸癌，并且250,000位女性死于宮頸癌[2]。16、18、45、31、33、52、58、35和59型被認(rèn)為是為導(dǎo)致宮頸癌的高風(fēng)險類型的HPV，而6和11型被認(rèn)為是低風(fēng)險類型的HPV[3,4]。特別地，HPV16和HPV18被認(rèn)為導(dǎo)致全部宮頸癌的70％，并且因此被認(rèn)為是是預(yù)防宮頸癌的最重要類型[5]。導(dǎo)致宮頸癌的HPV類型不同地區(qū)而有所不同[5]。在非洲、歐洲、北美以及中南美洲，HPV16、HPV18、HPV31和HPV45感染為宮頸癌的主要原因，在亞洲，HPV16、HPV18、HPV58和HPV33感染為宮頸癌的主要原因[5]。

HPV的衣殼由作為主要抗原的L1蛋白和作為次要抗原的L2蛋白組成[6]。在這里，L1蛋白已被用作用于預(yù)防宮頸癌的疫苗的抗原和用于診斷宮頸癌的抗原，因為其具有自組裝形成病毒樣顆粒(VLP)的特性[6,27]。重組L1蛋白在大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia Pastoris)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)或草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf)細(xì)胞，或者植物細(xì)胞中作為表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)[7-12,28]。目前，商用宮頸癌疫苗為Gardasil^TM(Merck)和Cervarix^TM(GlaxosmithKline,GSK)。Gardasil^TM包括HPV16、HPV18、HPV6和HPV11作為抗原的L1VLP，并且Cervarix^TM包括HPV16和HPV18作為抗原的L1VLP[13]。Gardasil^TM使用釀酒酵母作為抗原表達(dá)細(xì)胞，Cervarix^TM使用草地貪夜蛾(Sf)細(xì)胞作為抗原表達(dá)細(xì)胞，其為昆蟲細(xì)胞[13,14]。兩種疫苗均通過肌肉注射而被注射，并且具有每劑120美元的高成本，三劑需要360美元[15]。由于商用宮頸癌疫苗的注射成本高，所述疫苗在發(fā)展中國家的廣泛使用受到許多限制，而宮頸癌主要發(fā)生在發(fā)展中國家中[16]。據(jù)此，低成本和高效的宮頸癌疫苗的研發(fā)就仍將是一個重要的課題。

在使用重組蛋白的藥物中，下游加工成本高至總制造成本的80％[17]。為了制造用于宮頸癌疫苗的抗原，使用了通過在下游加工中的數(shù)個提純步驟來提高目標(biāo)抗原純度的方法[18]。在釀酒酵母中生產(chǎn)VLP的情況中，為了提高目標(biāo)蛋白的純度，主要使用蔗糖墊層超速離心或排阻層析。為了提純VLP，Hofmann等使用蔗糖墊層超速離心、陰離子交換層析、硫酸銨沉淀和排阻層析[19]。Kim等相繼地使用蔗糖墊層超速離心、排阻層析和陽離子交換層析來提純VLP[7]。Park等使用的提純方法包括硫酸銨沉淀、排阻層析和陽離子交換層析，其被相繼地執(zhí)行[20]。根據(jù)所述方法，可以獲得高純度VLP，但是所述方法會限制提純裝置的增大，并且不適用于在大規(guī)模生產(chǎn)中使用。