[發明專利]位點特異性整合

有效

• 申請號: 201380032837.8
• 申請日: 2013-06-20
• 公開（公告）號: CN104379753B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: J·朗斯;R·揚;M·J·奧古斯汀諾;M·莫法特;張林;張保宏
• 申請（專利權）人: 英國龍沙生物醫藥股份有限公司;輝瑞公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N5/10;C12N15/10
• 代理公司: 隆天知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 王芝艷;吳小瑛

本發明涉及穩定且高產的位點特異性整合(SSI)宿主細胞，如源自中國倉鼠卵巢(CHO)的宿主細胞，其生產方法及其用途。

說明

技術領域

本發明涉及穩定且高產的位點特異性整合(SSI)宿主細胞，如源自中國倉鼠卵巢(CHO)的宿主細胞，其生產方法及其用途。

背景技術

開發中的生物制藥候選物的數量的增長已經刺激了開發有效且快速的用于開發細胞系的高通量技術的需求，因為使用常規方法生產商業細胞系是一個耗時、勞動密集且重復的過程。在構建和選擇抗體生產細胞系的過程中，獲得了具有寬范圍的表達、生長和穩定曲線(profile)的細胞系。這些變化可由于哺乳動物基因組的固有可塑性而發生。這些變化也可來源于隨機的基因調節網絡或重組蛋白量的變化，重組蛋白的產生主要歸因于“位置斑駁效應”(position variegation effect)的轉基因的隨機基因組整合。

做為這些變化和低(1/10,000)頻率的基因組整合的結果，需要資源密集的和費時的工作以篩選群體(pool)中的許多轉染體以查找這些罕見事件，以分離可商業應用的生產細胞系(例如生長良好、高產且生產穩定的組合，且其具有所希望的產物譜)。可以通過使用高嚴謹性選擇系統如GS(谷氨酰胺合成酶)基因表達系統富集高產細胞系以改善此種情況。例如，在最近的一項研究中，大于30％的隨機選擇的產175mAb(單克隆抗體)的GS-CHOK1SV(GS Gene expression system^TM，Lonza)細胞系的組在分批補料搖瓶法中產生了＝1g/L的mAb。CHOK1SV內源表達GS酶，因此，可以使用不含谷氨酰胺的培養基并用甲硫氨酸亞砜(MSX)選擇來獲得陽性轉染體。盡管有這樣的高效選擇系統，還是需要嚴格費力的篩選機制。因此，構建生產性細胞系是一個費力且漫長的過程。不僅需要選擇這些細胞系的陽性生長和生產特性，還需要對其進行克隆，并且基本上需要在生產過程中生產正確質量的產品。此外， 為了獲得一個經濟的過程，所產生的細胞系需要在許多世代的細胞中表現出一致的產率。令人滿意的情況將是：提供一種高產的細胞系，其在每次表達新的目標蛋白(如新的單克隆抗體)時，具有陽性生長特性且具有最小的篩選活性。

發明內容

本發明的技術問題是克服上述的缺陷，特別是提供具有高穩定性和陽性生長以及生產率特性的高產細胞系，優選通過簡單和有效的方式進行，尤其是在長期培養和生產周期中提供恒定生產率的細胞系。

根據獨立權利要求教導的規定，本發明解決了下述技術問題。

特別地，本發明通過提供一種包含內源Fer1L4基因的位點特異性整合(SSI)宿主細胞，解決了該技術問題，其中將外源核苷酸序列整合到所述Fer1L4基因中。在一些實施方式中，外源核苷酸序列包含至少一個編碼目標序列的基因。在一些實施方式中，外源核苷酸序列包含至少兩個重組靶位點。在一些實施方式中，重組靶位點位于至少一個編碼目標序列的基因的側翼。在其它實施方式中，重組靶位點鄰近但不位于至少一個編碼目標序列的基因的側翼。在一些實施方式中，編碼目標序列的基因包含至少一個選擇標記物基因。

在一個優選的實施方式中，本發明預見到，整合到內源Fer1L4基因中的外源核苷酸序列是兩個重組靶位點，其位于至少一個編碼目標序列的基因的側翼，優選地，位于至少一個選擇標記物基因的側翼，即一個第一重組靶位點位于至少一個編碼目標序列的基因的5'上游并且一個第二重組靶位點位于至少一個編碼目標序列的基因的3'下游，優選至少一個選擇標記物基因。

優選地，編碼目標序列的基因可以是編碼目標蛋白的核苷酸序列，如抗體、抗原、酶、可檢測的蛋白如熒光蛋白(如綠色熒光蛋白)、激素、生長因子、受體、融合蛋白或具有選擇功能的蛋白。所述核苷酸序列可被功能性地連接到至少一種調控元件如啟動子上。優選地，編碼目標序列的基因是一個選擇標記物基因。