[發(fā)明專利]位點特異性整合

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380032837.8
• 申請日: 2013-06-20
• 公開（公告）號: CN104379753B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發(fā)明（設計）人: J·朗斯;R·揚;M·J·奧古斯汀諾;M·莫法特;張林;張保宏
• 申請（專利權）人: 英國龍沙生物醫(yī)藥股份有限公司;輝瑞公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N5/10;C12N15/10
• 代理公司: 隆天知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 王芝艷;吳小瑛

1.一種包含內源Fer1L4基因的位點特異性整合(SSI)宿主細胞，其中外源核苷酸序列被整合在所述Fer1L4基因中，并且其中所述外源核苷酸序列包括至少2個重組靶位點序列。

2.根據權利要求1所述的SSI宿主細胞，其中所述外源核苷酸序列包含編碼目標序列的基因。

3.根據權利要求2所述的SSI宿主細胞，其中所述至少2個重組靶位點位于編碼目標序列的基因的側翼。

4.根據權利要求2所述的SSI宿主細胞，其中所述編碼目標序列的基因包含一個或多個編碼選擇標記物、可檢測的蛋白、抗體、肽抗原、酶、激素、生長因子、受體、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因。

5.根據權利要求3所述的SSI宿主細胞，其中所述編碼目標序列的基因包含一個或多個編碼選擇標記物、可檢測的蛋白、抗體、肽抗原、酶、激素、生長因子、受體、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因。

6.根據權利要求1所述的SSI宿主細胞，其中所述重組靶位點是FRT位點或lox位點。

7.根據權利要求4所述的SSI宿主細胞，其中所述選擇標記物是GS選擇標記物、潮霉素選擇標記物、嘌呤霉素選擇標記物或胸苷激酶選擇標記物。

8.根據權利要求1到7任一項所述的SSI宿主細胞，其中所述宿主細胞是小鼠細胞、人類細胞或CHO宿主細胞、CHOK1宿主細胞或CHOK1SV宿主細胞。

9.根據權利要求1到7任一項所述的SSI宿主細胞，其中所述宿主細胞是CHO細胞，并且其中外源核苷酸序列的3′端側翼序列為如SEQ ID No.7、8給出的核苷酸序列的至少之一，且其5′端側翼序列為如SEQ ID No.9給出的核苷酸序列。

10.根據權利要求1到7任一項所述的SSI宿主細胞，其中所述外源核苷酸序列替換了Fer1L4基因的一部分。

11.根據權利要求6所述的SSI宿主細胞，其中所述宿主細胞包含FRT位點，其是野生型FRT位點或突變型FRT位點。

12.根據權利要求1所述的SSI宿主細胞，其中所述重組靶位點包含至少一個野生型FRT位點和至少一個突變型FRT位點。

13.一種用于生產SSI宿主細胞的方法，其包括以下步驟：

a)提供一種包含內源Fer1L4基因的細胞，其中外源核苷酸序列被整合進所述Fer1L4基因，并且其中所述外源核苷酸序列包含至少兩個重組靶位點，重組靶位點位于至少一個編碼目標序列的第一基因的側翼；然后

b)用包含第一可交換盒的載體轉染步驟a)中所提供的細胞，所述盒包含至少兩個匹配的重組靶位點，其位于至少一個編碼目標序列，即選擇標記物基因的第二基因的側翼，然后

c)產生定點重組介導的盒式交換，并且然后

d)選擇表達編碼目標序列，即選擇標記物基因的第二基因的轉染的細胞，從而獲得包含穩(wěn)定整合在宿主細胞基因組中的第一可交換盒的所述SSI宿主細胞。

14.根據權利要求13所述的方法，進一步包括：i)用包含至少一個第二可交換盒的載體轉染SSI宿主細胞，該盒包含至少兩個位于至少一個編碼目標序列的第三基因的側翼的匹配的重組靶位點和至少一個選擇標記物，ii)產生定點重組介導的盒式交換，以獲得包含編碼目標序列的第三基因的SSI宿主細胞，iii)使獲得自步驟ii)的SSI宿主細胞表達編碼目標序列的第三基因，和iv)回收編碼目標序列的第三基因的產物。