[發明專利]核酸復合物及核酸多糖復合物

在審

• 申請號: 201380032032.3
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN104471063A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 櫻井和朗;望月慎一;田中素子;樋口貞春
• 申請（專利權）人: 獨立行政法人科學技術振興機構
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/711;C07H21/04
• 代理公司: 北京青松知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11384
• 代理人: 鄭青松

技術領域

本發明涉及一種提高包含DNA與RNA的核酸復合物的血清中穩定性的技術。

背景技術

人類基因組的解讀，已經在距離發現DNA雙螺旋結構的1953年之后的第50年、即2003年完成。目前，正在進行闡明各種蛋白質的活性機理以及蛋白質間的相互作用。并且最近逐漸了解到，不編碼蛋白質的RNA控制著基因的轉錄、翻譯。作為應用這樣的成果的方法之一，提出了使用具有生理活性的短人工核酸(核酸藥物)操控生物體功能的技術。

小干擾RNA(small?interfering?RNA，即siRNA)是由21～23個堿基對構成的低分子雙鏈RNA。siRNA參與被稱為RNA干擾(RNAi)的現象(參照非專利文獻1)、序列特異性地阻遏信使RNA(mRNA)，抑制蛋白質表達。通常認為，該現象是生物體作為應對病毒感染等的防御機制的一環節而逐漸進化形成的。由于僅基于基因序列信息就能夠設計出，因此不需要如此前的低分子藥物那樣的大規模篩選，此外，由于能夠特異性地阻遏特定基因，因此認為副作用小，預期將成為新一代治療藥。

但是，作為天然型核酸的磷酸酯型RNA，在生物體內由于核酸酶、與蛋白質的非特異性吸附會在極短時間內失活。因此，天然型核酸藥品在人類臨床研究中并未帶來有意義的效果。為了解決天然型核酸這樣的在生物體環境內和培養液中短時間內失活的問題，提出了多種對天然型核酸進行化學修飾而成的化學修飾核酸。尤其已知的是：例如將核糖的2’-位的羥基用甲氧基(2’-O-甲基)(參照非專利文獻2)、氟(F)(參照非專利文獻3)、鎖式核酸(locked?nucleic?acid)(LNA)(參照非專利文獻4)進行化學修飾而得到的化學修飾核酸。此外，還報道了這樣的化學修飾使得siRNA與靶mRNA的結合親和性提高。

將這樣的化學修飾核酸稱為核酸類似物。核酸類似物與天然型核酸相比成功地大幅度延長了失活時間。這是由于核酸酶無法識別核酸類似物。但是，產生了在生物體內與蛋白質發生非特異性吸附、無法預期的生理活性、引起重度肝損傷等由非天然所帶來的毒性問題。

還提出了如下技術：將天然型核酸包封至具有生物體適合性的化合物中，保護核酸不被分解，并且改善膜透過性從而將核酸導入細胞內。逆轉錄病毒(參照非專利文獻5)或腺病毒(參照非專利文獻6)等雖然已經獲知作為基因載體在體外是極有前途的，但是這些天然來源的病毒的炎癥性、免疫原性、以及誘導突變及重組到細胞基因組中風險性也備受指摘，這些使其在體內的使用受到限制。

因此，提出了一種作為天然來源的基因載體的代替物的、不僅操作比病毒系統簡單而且能夠使DNA切實向細胞高效率集中的、人工材料作為非病毒載體的用途(參照非專利文獻7)。迄今為止，作為非病毒性的人工核酸載體，已經開發出聚乙二醇修飾的多聚陽離子(參照非專利文獻8)、聚乙烯亞胺(參照非專利文獻9)、陽離子性聚合物的嵌段共聚物(參照非專利文獻10)、樹枝狀高分子(參照非專利文獻11)等。但是，這樣的陽離子性高分子的安全性尚未確認。為了具有陽離子性，氨基的存在是必不可少的，但是氨基的生理活性高，存在體內毒性等風險。

本發明人著眼于此前作為基因載體的β-1,3-葡聚糖，已經發現了β-1,3-葡聚糖與核酸藥物(反義DNA、CpG?DNA)形成新型的復合物的現象(參照專利文獻1、2，非專利文獻12、13、14)。

我們發現，將天然以3螺旋存在的β-1,3-葡聚糖溶解于二甲基亞砜(DMSO)等非質子性極性有機溶劑、或0.1N以上的堿溶液使其解離為單鏈后，加入單鏈的核酸，使溶劑變為水或恢復至中性，由此形成了由1分子核酸與2分子多糖構成的3螺旋復合物。我們認為，此時，3螺旋復合物中的多糖分子與核酸分子主要是通過氫鍵與疏水性相互作用而形成分子間結合的(參照非專利文獻15)。

如上所述，已經報道了與β-1,3-葡聚糖復合化的核酸為單鏈核酸，尤其聚脫氧腺嘌呤(poly?dA)、聚胞嘧啶(poly?C)與以西佐喃(sizofiran，SPG)為首的β-1,3-葡聚糖顯示出強親和性。

對于以β-1,3-葡聚糖作為siRNA的載體應用于RNAi也進行了研究。但是，siRNA為雙鏈核酸，因此不能直接與β-1,3-葡聚糖形成復合物。因此，為了與SPG等β-1,3-葡聚糖復合化，準備了對siRNA的正義鏈附加poly(dA)而成的DNA-RNA雜化核酸，使其與siRNA的反義鏈退火，從而制作了poly(dA)-siRNA。然后，利用poly(dA)部分與SPG進行復合化。

現有技術文獻

專利文獻