[發(fā)明專利]核酸酶介導(dǎo)的使用大靶向載體的靶向

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380030738.6
• 申請日: 2013-04-25
• 公開（公告）號: CN104364380B
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: D·弗倫德維;W·奧爾巴克;D·M·瓦倫澤拉;G·D·揚(yáng)科普洛斯;K·V·萊
• 申請（專利權(quán)）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C07K14/715
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 鄔玥;葛強(qiáng)

本申請?zhí)峁┝送ㄟ^使用同源重組在基因組的靶基因座制備一種或多種經(jīng)靶向的基因修飾的組合物和方法，其中通過在所述靶基因組的基因座或其附近的單鏈或雙鏈的斷裂促進(jìn)所述同源重組。本申請還提供了使用工程改造的核酸酶在原核或真核細(xì)胞中提高LTVEC和基因組的靶基因座之間同源重組效率的組合物和方法。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2012年4月25日提交的美國臨時申請?zhí)?1/638,267的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本申請。

發(fā)明領(lǐng)域

核酸酶和DNA構(gòu)建體包括靶向載體(例如，大靶向載體，“LTVEC”)以用于實現(xiàn)在基因組的靶基因座的同源重組。本申請?zhí)峁┝送ㄟ^使用同源重組制備經(jīng)靶向的基因修飾的組合物和方法，其中通過在基因組的靶基因座或其附近的單鏈或雙鏈斷裂促進(jìn)所述同源重組。本申請?zhí)峁┝耸褂霉こ谈脑斓暮怂崦冈谠嘶蛘婧思?xì)胞中提高LTVEC和基因組的靶基因座之間同源重組效率的組合物和方法。

背景技術(shù)

使用靶向載體的同源重組是一種在非人動物中獲得所需基因組修飾的流行方法，所述靶向載體被特別設(shè)計以便在基因組的基因座加入、缺失或取代特定的核酸序列。被特異性工程改造以便在基因組的靶基因座或其附近引入單鏈或雙鏈斷裂的核酸酶能夠與靶向載體一起使用以提高在基因組的靶基因座同源重組的效率。

盡管通過同源重組進(jìn)行基因組修飾的技術(shù)在最近二十年中已經(jīng)相當(dāng)先進(jìn)，但是在很多情況下使用非常大的靶向載體LTVEC達(dá)到可接受的靶向頻率仍存在困難，例如當(dāng)使用較多的人源基因組片段取代較大部分的嚙齒動物基因組時，或者靶向某些細(xì)胞類型時存在困難，例如成纖維細(xì)胞或其他體細(xì)胞。在本領(lǐng)域中需要用于使用LTVEC修飾真核基因組的較大基因組基因座的更多的和改進(jìn)的方法。

發(fā)明概述

本申請?zhí)峁┝耸褂么蟀邢蜉d體(LTVEC)聯(lián)合核酸酶試劑修飾基因組中感興趣的基因座的組合物和方法，所述組合物和方法使得在基因組中感興趣的基因座上能夠有效進(jìn)行較大的核酸序列的缺失、加入(例如插入)和/或取代。

本申請?zhí)峁┝耸褂肔TVEC和核酸酶試劑通過細(xì)菌同源重組(BHR)在原核細(xì)胞中修飾哺乳動物基因組的靶基因座的組合物和方法，其中通過所述核酸酶試劑在基因組的靶基因座或其附近產(chǎn)生的單鏈或雙鏈斷裂促進(jìn)所述BHR。本申請?zhí)峁┝税琇TVEC和核酸酶試劑的原核細(xì)胞，所述核酸酶試劑在表達(dá)后能夠在靶位點或其附近引入單鏈或雙鏈斷裂。本申請?zhí)峁┝擞糜谕ㄟ^使用本申請所述的各種LTVEC和核酸酶在發(fā)生重組的原核細(xì)胞中使用外源性的核酸序列(例如，同源的或直系同源的人源基因組核酸序列)取代非人動物較大的基因組基因座的組合物和方法。

本申請?zhí)峁┝嗽诟鞣N多能性哺乳動物細(xì)胞中使用LTVEC和核酸酶試劑修飾基因組中感興趣的基因座的組合物和方法。本申請?zhí)峁┝擞糜谕ㄟ^使用本申請所述的各種LTVEC和核酸酶在非人動物的多能細(xì)胞中使用外源性的核酸序列(例如，同源的或直系同源的人源基因組核酸序列)取代非人動物較大的基因組基因座的組合物和方法。

本申請?zhí)峁┝朔侨藙游锏亩嗄芗?xì)胞，所述細(xì)胞包含本申請所述的各種LTVEC和核酸酶試劑。

本申請?zhí)峁┝擞糜谏山?jīng)基因修飾的非人動物的組合物和方法，所述經(jīng)基因修飾的非人動物包含如本申請所述的一個或多個經(jīng)靶向的基因修飾。

在一個方面，本申請?zhí)峁┝艘环N原核細(xì)胞，所述原核細(xì)胞包含大靶向載體(LTVEC)，所述載體包含定向至靶基因座的同源臂，和編碼核酸酶試劑的核酸序列，所述核酸酶試劑在所述靶基因座或其附近形成單鏈或雙鏈斷裂。

在一個實施方式中，所述原核細(xì)胞能表達(dá)介導(dǎo)細(xì)菌同源重組(BHR)的重組酶。在一個實施方式中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌的具有重組能力的菌株。