[發(fā)明專利]核酸酶介導(dǎo)的使用大靶向載體的靶向

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380030738.6
• 申請日: 2013-04-25
• 公開（公告）號: CN104364380B
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: D·弗倫德維;W·奧爾巴克;D·M·瓦倫澤拉;G·D·揚(yáng)科普洛斯;K·V·萊
• 申請（專利權(quán)）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C07K14/715
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 鄔玥;葛強(qiáng)

1.一種在小鼠胚胎干（ES）細(xì)胞中修飾基因組的靶基因座的方法，所述方法包括：

（a）引入所述小鼠胚胎干（ES）細(xì)胞：

（i）鋅指核酸酶（ZFN），所述鋅指核酸酶在基因組的靶基因座或其附近產(chǎn)生單鏈或雙鏈斷裂；和

（ii）大靶向載體（LTVEC），所述大靶向載體包含翼側(cè)為上游同源臂和下游同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸的長度為5kb至30kb，其中所述上游同源臂和所述下游同源臂的總和是至少10kb，其中所述上游同源臂和所述下游同源臂的長度為5kb至200kb，并且其中所述LTVEC的長度范圍為50kb至300kb；以及

（b）選擇經(jīng)靶向的小鼠胚胎干（ES）細(xì)胞，所述小鼠胚胎干（ES）細(xì)胞包含在所述基因組的靶基因座中的所述插入核酸，其中將所述插入核酸整合進(jìn)入所述基因組的靶基因座使得所述插入核酸取代所述基因組的靶基因座處的內(nèi)源核酸序列，其中與單獨(dú)使用LTVEC相比，聯(lián)合使用所述LTVEC與所述ZFN使得靶向效率增加。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與單獨(dú)使用LTVEC相比，所述LTVEC的靶向效率增加至少2倍。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ZFN是表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼ZFN蛋白的核酸序列，并且其中所述核酸與在所述細(xì)胞中有活性的啟動子可操作地連接。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ZFN是編碼ZFN蛋白的mRNA。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸酶試劑的靶序列位于所述基因組的靶基因座的內(nèi)含子、外顯子、啟動子或增強(qiáng)子區(qū)中。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含選擇性表達(dá)盒。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含報(bào)告基因。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述插入核酸含有條件型等位基因或翼側(cè)為位點(diǎn)特異性重組靶序列的核酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述插入核酸整合進(jìn)入所述基因組的靶基因座使得在所述基因組的靶基因座缺失內(nèi)源性基因。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述插入核酸整合進(jìn)入所述基因組的靶基因座導(dǎo)致敲除、敲入、點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)域交換、外顯子交換、內(nèi)含子交換、調(diào)節(jié)序列交換、基因交換或其組合。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含人源核酸序列。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述插入核酸包含人疾病等位基因。

13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述插入核酸包含編碼人源免疫球蛋白重鏈可變區(qū)氨基酸序列的基因組核酸序列。

14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述插入核酸包含編碼人源免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的基因組核酸序列。

15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述基因組核酸序列包含未經(jīng)重排的人源λ和/或к輕鏈可變區(qū)核酸序列。

16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述基因組核酸序列包含重排的人源λ和/或к輕鏈可變區(qū)核酸序列。

17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述插入核酸包含與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)核酸序列可操作地連接的未經(jīng)重排的或重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區(qū)核酸序列。