[發(fā)明專利]經修飾纖維黏連蛋白片段或變體及其用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380030284.2
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN104968796A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發(fā)明（設計）人: 莊偉哲;張永升
• 申請（專利權）人: 莊偉哲
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 北京律盟知識產權代理有限責任公司 11287
• 代理人: 林斯凱

技術領域

本發(fā)明大體上系關于細胞生物學，且特定言之，細胞外基質蛋白(extracellular?matrix?protein)與整合素(integrin)的功能及相互作用。更特定言之，本發(fā)明系關于作為整合素(尤其整合素α5β1及整合素αvβ3)的特定拮抗劑的人類纖維黏連蛋白(fibronectin)片段及/或其變體。隨本文所提交的序列txt文件以全文引用的方式并入本文中。

背景技術

整合素為介導細胞-基質及細胞-細胞相互作用的醣蛋白膜受體家族。整合素為雜二聚體，由α及β次單元組成。迄今為止已描述至少24種不同整合素雜二聚體，包括18種α次單元及8種β次單元。整合素藉助于與不同細胞外基質(ECM)蛋白的特定相互作用來介導細胞的固著及遷移。另外，細胞存活、分裂及分化亦依賴于有效的細胞-ECM結合(Morgan等人2009,IUBMB?Life,61:731-38)。

整合素α5β1及αvβ3聚集在培養(yǎng)細胞的黏附接觸處。整合素-ECM復合物不僅用以維持固著及遷移所需的細胞-細胞及細胞-基質的相互作用，細胞-ECM復合物之形成亦藉由在細胞內部補充酶及接附蛋白形成動力學復合物來觸發(fā)整合素介導的細胞內信號傳導。整合素的細胞內信號輸出可影響基因表達、細胞存活、分化及增殖。整合素已牽涉許多病理性狀況(諸如血管生成及腫瘤發(fā)展)。

已知若干整合素與纖維黏連蛋白藉助于纖維黏連蛋白中存在的Arg-Gly-Asp(RGD)基元(motif)而相互作用。此等整合素包括5種αv整合素(αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8)及兩種β1整合素(α5β1及α8β1)(Smith,W.,2008,J.Allergy?Clin.Immunol.121:S375-S379)。纖維黏連蛋白為高分子量(約440kDa)的細胞外基質醣蛋白，其與整合素以及其他細胞外基質蛋白結合。纖維黏連蛋白以在C末端由雙硫鍵鍵聯的兩個單體的二聚體形式存在。各纖維黏連蛋白單體的分子量為230-250kDa，含有三種類型的域：類型I、II及III。類型I及II域由鏈內雙硫鍵穩(wěn)定，而類型III域不含有任何雙硫鍵。缺乏雙硫鍵可使得FN類型III域的結構具有柔性。

各域含有多個經組織以沿纖維黏連蛋白單體的長度方向形成功能性及結合蛋白質的區(qū)的模塊。舉例而言，需要類型I域中的模塊以用于引發(fā)纖維黏連蛋白受質組裝，而類型I及類型III域兩者中的模塊對與其他纖維黏連蛋白分子結合而言為至關重要的。RGD基元位于類型III域的模塊10(FNIII?10)中，且構成纖維黏連蛋白與整合素α5β1及αvβ3的結合位點。類型III域模塊9(FNIII9)中的序列，尤其PHSRN協(xié)同環(huán)，促使纖維黏連蛋白與整合素α5β1結合。纖維黏連蛋白的整合素αvβ3結合不需要模塊9的協(xié)同效應。

因為整合素在調控多種細胞功能中的作用，所以已研究使用整合素拮抗劑治療疾病的可行性。舉例而言，實驗使用整合素αIIbβ3(活化血小板凝集的整合素)的拮抗劑作為用于治療血栓癥相關的局部缺血性血管疾病的抗凝劑(Coller等人，2008,Blood,112:3011-25)。解整合素(disintegrin)(諸如蛇毒蛋白(Rhodostomin))為在蛇毒液中天然發(fā)現的抑制整合素介導的血小板凝集及細胞黏附的較小蛋白質整合素拮抗劑家族。然而，解整合素不具有特異性，且具有高度免疫原性。其與纖維黏連蛋白競爭結合細胞表面上含有β1及β3的整合素，且無差別地抑制整合素α5β1、αvβ3及整合素αIIbβ3的活性。因此，使用解整合素作為整合素α5β1及αvβ3的拮抗劑具有高出血風險，歸因于其aIIbβ3拮抗劑活性防止血小板凝集及血液凝固。

類似地，假結核耶爾森氏菌(Yersinia?pseudotuberculosis)蛋白侵襲素為結合整合素的蛋白。細菌侵襲素蛋白藉由與整合素結合來促使細菌進入細胞。使用侵襲素作為整合素拮抗劑有問題，因為細菌蛋白質可能具有高度免疫原性，且因為侵襲素蛋白的特異性不確定。