[發明專利]制備在利用核酸聚合酶來檢測核酸時使用的高精度核酸的方法

有效

• 申請號: 201380029805.2
• 申請日: 2013-04-08
• 公開（公告）號: CN104350159B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 樸翰浯;李晙凞;金懸書;崔昭羅;金鍾勲
• 申請（專利權）人: 株式會社百奧尼
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6848;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 陳桉

1.一種在使用核酸聚合反應擴增核酸前制備所述核酸以防止核酸非特異性引發的方法，所述方法包括：

1)通過使包括核酸、核酸聚合酶、酶反應緩沖液和核酸聚合終止子的反應混合物反應來終止所述核酸的3’末端，所述核酸聚合終止子抑制所述核酸的3’末端的延伸；和

2)從所述反應混合物中滅活或消除未反應的游離的核酸聚合終止子，所述核酸聚合終止子起著隨后的聚合鏈式反應或PCR反應的抑制劑的作用；

其中制備的核酸用于使用核酸聚合反應來擴增和檢測核酸，

其中所述步驟2)中消除核酸聚合終止子是通過使用凝膠過濾或離液劑來實現。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合反應通過引發而起始。

3.根據權利要求2所述的方法，其中所述核酸聚合反應為選自由以下反應構成的組中的至少一種：RNA依賴型RNA聚合酶反應、DNA依賴型RNA聚合酶反應、RNA依賴型DNA聚合酶反應和DNA依賴型DNA聚合酶反應。

4.根據權利要求1所述的方法，其中步驟1)中的核酸被分離并純化以便能夠終止反應。

5.根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸為RNA或DNA，所述核酸聚合酶為選自由以下物質構成的組中的至少一種：RNA依賴型RNA聚合酶、RNA依賴型DNA聚合酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶。

6.根據權利要求5所述的方法，其中所述RNA依賴型RNA聚合酶為來自黃病毒的NS5酶。

7.根據權利要求5所述的方法，其中所述RNA依賴型DNA聚合酶為選自由以下物質構成的組中的至少一種：MMLV逆轉錄酶、AMV逆轉錄酶和HIV逆轉錄酶。

8.根據權利要求5所述的方法，其中所述RNA聚合酶為作為3’末端轉移酶的poly(A)聚合酶。

9.根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合終止子是類核酸化合物，所述類核酸化合物以能夠作用于所述核酸聚合酶的三磷酸酯形式被活化，而無所述核酸的3’羥基的羥基。

10.根據權利要求9所述的方法，其中所述類核酸化合物選自由以下物質構成的組中的至少一種：2’3’-雙脫氧核苷5’-三磷酸、3’-脫氧腺苷5’-三磷酸、3’-疊氮-3’-脫氧胸苷5’-三磷酸、1-β-d-阿拉伯呋喃糖核苷5′-三磷酸、無環鳥苷三磷酸、3’-氨基-3’-脫氧核苷5’-三磷酸和3’-氟-3’-脫氧核苷5’-三磷酸。

11.根據權利要求10所述的方法，其中所述2’3’-雙脫氧核苷5’-三磷酸、3’-氨基-3’-脫氧核苷5’-三磷酸和3’-氟-3’-脫氧核苷5’-三磷酸包括選自脫氧鳥苷三磷酸，脫氧腺苷三磷酸，脫氧胸苷三磷酸，脫氧尿苷三磷酸和脫氧胞苷三磷酸組成的組的脫氧核苷三磷酸。

12.根據權利要求9所述的方法，其中所述步驟2)中滅活核酸聚合終止子為水解三磷酸酯的磷鍵水解酶。

13.根據權利要求12所述的方法，其中所述磷鍵水解酶為選自由以下物質構成的組中的至少一種：來自大腸桿菌、牛小腸和蝦的堿性磷酸酶，和自分泌運動因子。