[發明專利]制備在利用核酸聚合酶來檢測核酸時使用的高精度核酸的方法

有效

• 申請號: 201380029805.2
• 申請日: 2013-04-08
• 公開（公告）號: CN104350159B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 樸翰浯;李晙凞;金懸書;崔昭羅;金鍾勲
• 申請（專利權）人: 株式會社百奧尼
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6848;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 陳桉

本發明涉及一種制備具有高靈敏度的核酸的方法，其中在用于檢測痕量核酸的聚合反應(如PCR反應、實時定量PCR或類似反應)之前使用核酸聚合酶向待用于分析的核酸中加入終止子，使得可以基本上消除與靶核酸的擴增反應爭性地出現的非特異性引發，從而精確地僅檢測痕量的靶核酸并精確地測量靶核酸的濃度。

技術領域

本發明涉及一種制備在通過核酸聚合酶來檢測核酸時使用的、具高靈敏度的核酸的方法，更具體而言，本發明涉及一種制備核酸的方法，所述核酸通過防止非特異性核酸聚合而能夠檢測痕量核酸，所述非特異性核酸聚合是由于包含在提取自生物樣品的核酸中的單鏈核酸引起自引發(self-priming)所誘發，制備在核酸檢測中用于檢測核酸的核酸樣品的方法在室溫下使用PCR、RT-PCR、定量PCR、定量RT-PCR、轉錄擴增或核酸擴增所需的核酸聚合酶和引物。

背景技術

各種利用核酸聚合酶來檢測核酸的方法以高靈敏度和特異性已被用于各種檢查，例如針對病毒、病原體、致癌基因等的測試。高靈敏度可以通過利用檢測用的核酸聚合酶將靶核酸的數量擴增到上億或更多來實現。高特異性可通過利用與靶核酸特異性雜交的引物，以在雜交溫度下經由與靶核酸選擇性地雜交，通過引發(priming)而選擇性地進行核酸聚合反應來實現。然而，在諸如PCR反應、實時定量PCR反應等的具有多種核酸聚合酶的檢測方法中，對于檢測痕量的核酸而言，非特異性引發和隨后的聚合反應扮演著劣化檢測極限的主要因素。由于添加的引物與用于引發反應的靶核酸雜交，并且以眾多數量競爭性存在的單鏈核酸非特異性地且部分地雜交而引發，使得核酸聚合反應競爭性地出現，故造成非特異性擴增。

與針對DNA的檢測相比，針對大多數包括單鏈核酸的RNA的檢測通常以較小靈敏度進行。一般而言，用于檢測RNA的方法通過逆轉錄(RT)反應接著PCR反應來進行。對于具有高靈敏度的反應而言，RT反應首先在一個反應器中進行，在RT反應完成后，在單獨的反應器中利用RT反應產物進行PCR反應。

然而，在這種情況下，由于反應管需要再次打開以添加溶液，這不方便的且當打開反應管并進行操作時有被污染的高度可能性，故而主要使用通常在一個管中包括逆轉錄酶接著PCR反應的逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法。然而，在這種情況下，與分別進行反應的情況相比，存在靈敏度大大劣化的問題。

逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)在進行逆轉錄反應時需要引物，其中有使用隨機引物的方法和使用作為靶特異性引物的反義引物的方法。

使用隨機引物的方法能夠制備關于全部核酸的cDNA，因而已被主要用于制備cDNA庫或用于分析轉錄組的cDNA。然而，在檢測痕量RNA的情況下，由于合成了關于全部RNA的cDNA而制備了許多非靶cDNA，故非靶DNA的量過度增加，使得難以如上所述地檢測到靶。需要如上所述的高靈敏度的檢測(如RNA病毒診斷試劑盒)通常采用一種利用與靶RNA互補的反義引物的方法。

靶特異性反義引物通常能夠提高檢測極限。然而，即使使用靶特異性引物，由于在含有室溫下對RNA具有高活性的逆轉錄酶的混合反應溶液中，在低于引物雜交溫度的溫度下發生非特異性引發以及隨后的逆轉錄酶反應是不可避免的，故出現了制備出許多非特異性cDNA的問題。

一種被開發來克服上述問題并檢測痕量的核酸的技術是熱啟動PCR反應。熱啟動PCR反應是一種包括在低溫下的樣品混合過程以控制不起始PCR反應，然后僅在靶特異性引物的雜交溫度以上活化PCR反應的方法。

在該方法中，PCR反應僅在達到引物與靶核酸實現完全雜交的溫度后才起始，從而防止了在低于引物雜交溫度的溫度下具非特異性引發的PCR反應進程。作為一種特異性方法，開發了熱啟動PCR方法，其中反應溶液中包含作為聚合酶抑制劑的焦磷酸酯，且反應中額外包含降解焦磷酸酯的焦磷酸酶以通過在引物的雜交溫度下反應預定時間來消除焦磷酸酯，這樣接著起始PCR反應，從而可抑制在低溫下的非特異性核酸合成，以檢測痕量的核酸。熱啟動PCR方法描述于本申請的申請人所提交的韓國專利第10-1098764號中。