[發明專利]核苷酸擴增反應有效

申請號：	201380029231.9	申請日：	2013-06-07
公開（公告）號：	CN104662159B	公開（公告）日：	2021-10-26
發明（設計）人：	張宏華;佳露·蒲偉德;瑞查德·若斯	申請（專利權）人：	愛奧尼安技術公司
主分類號：	C12Q1/6844	分類號：	C12Q1/6844
代理公司：	中國專利代理(香港)有限公司 72001	代理人：	任曉華;周齊宏
地址：	美國加***	國省代碼：	暫無信息
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摘要：
搜索關鍵詞：	核苷酸擴增反應
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【說明書】：

方法包括使一種多核苷酸與一種擴增試劑混合物混合形成一種反應混合物，其中反應混合物包括在溶解狀態下的能可逆結合的二價離子，和調節反應混合物的pH來釋放可逆結合的二價離子，從而啟動多核苷酸的擴增。

技術領域

本發明涉及核苷酸擴增反應。

背景知識

很多酶，幾乎囊括了所有與核苷酸和大多數蛋白酶互作的酶，都需要二價離子的輔助。例如包含在核苷酸擴增反應中的酶通常需要二價鎂離子(Mg++)作為輔助劑。

核苷酸擴增能夠產生非特異性的擴增產物。在很多情況下，這是由于在擴增程序發生之前，非特異的寡核苷酸就可以啟動和隨后的引物延伸，這是因為所用的酶在室溫時通常是有活性的。例如，由于引物二聚體和隨后的延伸導致的擴增產物可以經常被觀察到。用于克服這個問題的常用方法包括所謂的“熱啟動”反應，其中被包括在擴增反應中(如酶或二價鎂離子輔助因子)的至少一種成分要么與反應混合物分開，要么保持失活狀態，直到反應混合物的溫度達到適宜的溫度。

發明內容

本發明是基于，至少部分基于，控制酶促反應改進的方法。

本發明也基于，至少部分基于，核苷酸擴增方法和組成成分的改進，該核苷酸擴增具有利用簡單試劑進行熱啟動的優勢。

一方面，本發明提供了一種方法包括：(a)使多(聚)核苷酸和擴增試劑混合形成反應混合物，其中，反應混合物包括當處于溶液中的可逆結合的二價離子，和(b)調節反應混合物中的pH值來釋放該可逆結合的二價離子，從而啟動多核苷酸的擴增。

在一些實施例中，二價離子從下列組合中選擇：鎂、鈣、銅、鋅、錳、鐵、鎘和鉛。

在一些實施例中，二價離子是鎂。

在本發明的任意實施例中，擴增試劑混合物可以包括一種pH敏感螯合劑。這種pH敏感螯合劑可以從下列組合中選擇：乙二醇-雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，EGTA的衍生物，和EDTA的衍生物。優選的溶液中的二價離子能與pH敏感螯合劑可逆結合。優選的pH敏感螯合劑是乙二醇-雙(2-氨基乙醚)四乙酸。

在本發明的任意實施例中，擴增試劑混合物可以包括一種溫度敏感緩沖液。在一些實施例中，溫度敏感緩沖液可以包括三(羥甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)。

在本發明的任意實施例中，反應混合物的pH可以通過溫度敏感緩沖液的pH而被調節。

在本發明的任意實施例中，通過改變反應混合物的溫度從第一溫度到第二溫度，反應混合物的pH可以被調節。

在本發明的任意實施例中，在第二溫度時溫度敏感緩沖液的pKa的值至少低于在第一溫度時溫度敏感緩沖液的pKa值的0.4。

在本發明的任意實施例中，溫度敏感緩沖液的ΔpKa值在-0.04℃^-1和-0.015℃^-1之間。