[發明專利]核苷酸擴增反應

有效

• 申請號: 201380029231.9
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN104662159B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 張宏華;佳露·蒲偉德;瑞查德·若斯
• 申請（專利權）人: 愛奧尼安技術公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 任曉華;周齊宏

1.方法，其包括：

(a) 使一種多核苷酸與一種擴增試劑混合物在第一溫度下混合形成一種反應混合物，其中，

(i) 該反應混合物包括pH敏感螯合劑，二價離子，切口內切核酸酶，和一種DNA或RNA的聚合酶，和

(ii) 在所述第一溫度下，該二價離子在溶解狀態下，能可逆結合所述的pH敏感螯合劑，從而，在該第一溫度下，使得所述多核苷酸的擴增被抑制；和

(b) 通過將反應混合物的溫度從第一溫度改變至第二溫度來調節反應混合物的pH來釋放可逆結合的二價離子，從而起始多核苷酸的擴增；

其中所述第一溫度為10℃至30℃之間且所述第二溫度為40℃至70℃之間；

其中pH敏感螯合劑濃度與二價離子濃度的比值為0.5至2；

其中第一溫度下游離二價離子的濃度為0至10mM之間；和

其中第二溫度下游離二價離子的濃度為5至50mM之間；

其中所述pH敏感螯合劑是濃度為14 mM或15 mM的EGTA，所述二價離子是濃度為15 mM的硫酸鎂，且其中擴增試劑混合物包括一種溫度敏感緩沖液，所述溫度敏感緩沖液包含三（羥甲基）氨基甲烷。

2.權利要求1的方法，其中反應混合物的pH根據溫度敏感緩沖液的pH被調節。

3.權利要求1-2中任一項的方法，其中反應混合物的pH通過改變反應混合物的溫度來調節，反應混合物的溫度從第一溫度變為第二溫度。

4.權利要求3的方法，其中第二溫度時溫度敏感緩沖液的pKa值低于第一溫度時溫度敏感緩沖液的pKa值的至少0.4。

5.權利要求1-2中任一項的方法，其中溫度敏感緩沖液的ΔpKa值在-0.04℃_-1和-0.015℃_-1之間。

6.權利要求1-2中任一項的方法，其中第一溫度為0℃至10℃之間，為10℃ 至20℃之間，或為20℃至30℃之間。

7.權利要求1-2中任一項的方法，其中第二溫度為30℃至40℃之間，為40℃至50℃之間，為50℃至60℃之間，為60℃至70℃之間，為70℃至80℃之間，為80℃至90℃之間，或為90℃至100℃之間。

8.權利要求1-2中任一項的方法，其中擴增試劑混合物包括一種切口內切核酸酶。

9.權利要求1-2中任一項的方法，其中擴增試劑混合物包括一種DNA或RNA聚合酶。

10.權利要求1-2中任一項的方法，其中擴增試劑混合物包括一種反轉錄酶。

11.權利要求1-2中任一項的方法，其中擴增試劑混合物包括一種或多種凍干形式的組分。

12.權利要求11的方法，其中擴增試劑混合物包括凍干形式的鎂鹽。

13.權利要求11的方法，其中擴增試劑混合物包括一種凍干形式的pH敏感螯合劑。

14.權利要求12的方法，其中凍干的鎂鹽被重溶在緩沖液中來形成溶解狀態的鎂離子。

15.權利要求13的方法，其中凍干形式的pH敏感螯合劑被重溶在緩沖液中。

16.權利要求14或15的方法，其中溶解狀態的鎂離子與pH敏感螯合劑可逆結合。

17.權利要求14或15的方法，其中該緩沖液是溫度敏感緩沖液。

18.權利要求14-15中任一項的方法，其中緩沖液的pH對于pH敏感螯合劑可逆結合溶液中的游離鎂離子是可操控的。