[發(fā)明專利]使用重組負(fù)鏈RNA病毒載體表達(dá)異源蛋白質(zhì)的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380029031.3
• 申請(qǐng)日: 2013-05-24
• 公開（公告）號(hào): CN104379752A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 瑪麗安·維甘德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 阿穆瓦克有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/86
• 分類號(hào): C12N15/86;C12N5/071
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;楊生平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種使用復(fù)制缺陷的但有轉(zhuǎn)錄能力的重組負(fù)鏈RNA病毒在細(xì)胞中表達(dá)至少一種異源核酸序列的方法。特別地，本發(fā)明涉及將細(xì)胞重編程為較低分化狀態(tài)的體外方法和使用所述重組負(fù)鏈RNA病毒載體的體內(nèi)和體外基因治療方法。此外，本發(fā)明涉及由所述體外方法制備的細(xì)胞或細(xì)胞群和所制備的細(xì)胞或細(xì)胞群作為藥物的用途。

背景技術(shù)

重組病毒載體為已知可用于將外源基因引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以介導(dǎo)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的幾種試劑中的一種。已將不同的病毒用于該目的，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，腺病毒，和腺相關(guān)病毒。這些重組病毒因其在病毒疫苗生產(chǎn)中的用途和作為基因治療載體用于治療基因缺陷疾病而被知曉。重組病毒的其它應(yīng)用包括通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和特定細(xì)胞的重新分化和重編程因子的表達(dá)而將細(xì)胞去分化為被稱作誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPS)的多能細(xì)胞。

在上述病毒介導(dǎo)方法中，與基因傳遞相關(guān)的一個(gè)嚴(yán)重問題是來(lái)自病毒載體的遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞基因組DNA中，這可導(dǎo)致宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。特別地，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因(例如編碼重編程因子的基因)傳遞，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的基因組整合。這可能會(huì)觸發(fā)原癌基因的激活或破壞腫瘤抑制基因，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。與整合病毒載體相關(guān)的另一個(gè)問題是整合的和下調(diào)的轉(zhuǎn)基因可被重新激活導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

其它問題包括用于基因傳遞的病毒可被傳遞到患者的鄰近的健康細(xì)胞或從患者傳遞到其他個(gè)體或環(huán)境中的可能性。另一個(gè)問題是所述病毒載體可能存留并造成不良影響，如對(duì)病毒成分的免疫反應(yīng)或病毒性感染的延遲效應(yīng)。此外，長(zhǎng)期的外源基因的表達(dá)可導(dǎo)致對(duì)自身抗原的類自身免疫反應(yīng)或干擾細(xì)胞過程如信號(hào)通路。

為了增加在體外和體內(nèi)過程中外源基因傳遞到宿主細(xì)胞的安全性，尤其是考慮到所述病毒載體的不期望的傳播，已提出不同的策略。例如，在WO?2006/084746?A1中描述了復(fù)制缺陷的但有轉(zhuǎn)錄能力的負(fù)鏈RNA病毒。由于其改進(jìn)的安全性，這種病毒被描述為適合作為活疫苗使用。

此外，為避免基因插入靶細(xì)胞基因組中引起的任何問題，嘗試引入不在靶細(xì)胞基因組中整合的病毒基因構(gòu)建體并允許異源基因產(chǎn)物的瞬時(shí)表達(dá)。例如，WO?2010/008054?A1描述了一種用染色體非整合的病毒載體如仙臺(tái)病毒(Sendai?virus)載體生產(chǎn)類ES(胚細(xì)胞)細(xì)胞的方法。然而，該病毒載體能在被感染的靶細(xì)胞中有效復(fù)制，并因此所生成的病毒顆粒將在每次細(xì)胞分裂后的子細(xì)胞中均勻分布。因此，所產(chǎn)生的類ES細(xì)胞在它們的細(xì)胞質(zhì)中包含不需要的高病毒載量。

在WO?2010/134526?A1中描述了相似的方法，其中仙臺(tái)病毒載體被用于將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)，所述仙臺(tái)病毒載體不導(dǎo)致載體序列整合入宿主細(xì)胞的基因組中，并因此降低由載體序列隨機(jī)整合入宿主基因組引起的致瘤性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。然而，由于WO?2010/134526?A1中所描述的仙臺(tái)病毒載體是有能力復(fù)制的，在重編程后需要付出相當(dāng)大的努力去除它以確保足夠的安全性。此外，由于在WO?2010/134526?A1使用的用于去除所述病毒的siRNA的遞送率(delivery?rate)和siRNA介導(dǎo)的表達(dá)抑制都沒有達(dá)到100％，該方法不能充分的排除與使用活病毒相關(guān)的健康風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明目的

考慮到現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種具有改進(jìn)的安全性且能在足夠長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)有效地表達(dá)異源核酸序列的新型病毒載體。特別地，本發(fā)明旨在提供用于在靶細(xì)胞中傳遞和表達(dá)編碼治療性蛋白質(zhì)的基因的方法，作為用于多種疾病的基因治療方法。此外，本發(fā)明旨在傳遞和表達(dá)編碼細(xì)胞重編程或編程因子的基因以將至少部分分化的細(xì)胞重編程為適合在再生治療中使用的較低分化的細(xì)胞或?qū)⒓?xì)胞編程為具有所需分化狀態(tài)的細(xì)胞。

發(fā)明概述

第一方面，本發(fā)明涉及一種在細(xì)胞中表達(dá)至少一種異源核酸序列的方法。所述方法可為體內(nèi)或體外方法且包含通過用包含至少一種異源核酸序列的重組負(fù)鏈RNA病毒載體感染細(xì)胞將至少一種異源核酸序列引入至細(xì)胞中的步驟，其中所述重組負(fù)鏈RNA病毒載體包括編碼導(dǎo)致病毒基因組復(fù)制能力喪失而病毒轉(zhuǎn)錄能力不喪失的突變的P蛋白的病毒基因組，和其中所述至少一種異源核酸序列編碼細(xì)胞重編程或編程因子或治療性蛋白質(zhì)。