[發明專利]使用重組負鏈RNA病毒載體表達異源蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201380029031.3
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN104379752A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 瑪麗安·維甘德
• 申請（專利權）人: 阿穆瓦克有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N5/071
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;楊生平

1.一種在細胞中表達至少一種異源核酸序列的方法，所述方法包括：

通過用包含至少一種異源核酸序列的重組負鏈RNA病毒載體感染細胞，將所述至少一種異源核酸序列引入至所述細胞中，

其中所述重組負鏈RNA病毒載體包含編碼導致病毒基因組復制能力喪失而病毒轉錄能力不喪失的突變的P蛋白的病毒基因組，和

其中所述至少一種異源核酸序列編碼細胞重編程或編程因子或治療性蛋白質。

2.根據權利要求1所述方法，其中所述重組負鏈RNA病毒載體為副粘病毒包括仙臺病毒，副流感病毒，雞新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒和人類呼吸道合胞體病毒，或彈狀病毒載體包括水皰性口炎病毒或狂犬病病毒。

3.根據權利要求1或2所述方法，其中所述P蛋白的突變為仙臺病毒P蛋白的氨基酸序列2-77的一個或多個氨基酸的缺失、插入或替換，或如果不是仙臺病毒，則為與仙臺病毒P蛋白的氨基酸序列2-77同源的氨基酸序列的缺失、插入或替換。

4.根據權利要求3所述方法，其中所述突變為

(a)仙臺病毒P蛋白的氨基酸2-77的缺失或，如果病毒不是仙臺病毒，則為與仙臺病毒P蛋白的氨基酸2-77同源的氨基酸的缺失，或

(b)仙臺病毒P蛋白的氨基酸33-41的缺失或，如果病毒不是仙臺病毒，則為與仙臺病毒P蛋白的氨基酸33-41同源的氨基酸的缺失。

5.根據權利要求1-4任一項所述方法，其中所述細胞重編程因子選自由Nanog、Oct-3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、ASCL1、MYT1L、TBX3b、SV40大T、hTERT、miR-291、miR-294、miR-295及其組合組成的組，和/或其中所述編程因子選自由神經生長因子(NGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、白細胞介素-6(IL-6)、骨形成蛋白(BMP)、神經源素3(Ngn3)、胰腺十二指腸同源框1(Pdx1)、田安(Mafa)及其組合組成的組。

6.根據權利要求1-5任一項所述方法，其中所述治療性蛋白選自由腺苷脫氨酶(ADA)、p91-PHOX、因子IX、因子VIII、囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)、β-球蛋白(HBB)、抗肌萎縮蛋白、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)、苯丙氨酸羥化酶(PAH)、葡糖苷酰鞘氨醇酶(GBA和GBA2)、原纖蛋白-1(FBN1)、亨廷頓蛋白(HTT)、載脂蛋白B(apoB)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(LDLRAP1)、前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)、α突觸核蛋白(SNCA)、帕金(PRKN)、富含亮氨酸重復激酶2(LRRK2)、PTEN誘導的推斷的激酶1(PINK1)、帕金森蛋白7(DJ-1)、ATP酶型13A2(ATP13A2)、腫瘤自殺基因產物、抗血管生成因子、自體腫瘤抗原包括酪氨酸酶相關蛋白2(TRP-2)和癌胚抗原(CEA)、免疫刺激因子、生長因子包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和上皮生長因子(EGF)、細胞因子包括白介素IL-2、IL-4、IL-5、IL-12和IL-17、免疫抑制劑及其組合組成的組。

7.根據權利要求1-6任一項所述方法，其是將至少部分分化的細胞重編程為較低分化的細胞或將要被編程的細胞編程至所需分化狀態的體外方法，所述方法包括：

(a)提供來自供體的至少部分分化的細胞或要被編程的細胞，

(b)通過用包含至少一種異源核酸序列的重組負鏈RNA病毒載體感染步驟(a)所提供的細胞，將所述至少一種異源核酸序列引入至所述細胞中，和

(c)在能有效表達所述至少一種異源核酸序列的條件下培養受感染的細胞，

其中所述至少一種異源核酸序列編碼細胞重編程或編程因子。

8.根據權利要求7所述方法，其中所述至少部分分化的細胞為選自由終末分化的體細胞、前體細胞、譜系限制性干細胞、成體干細胞和祖細胞組成的組的哺乳動物細胞。

9.根據權利要求7或8所述方法，其中至少部分分化的細胞被重編程為寡能、專能或多能細胞。

10.根據權利要求7所述方法，其中要被編程的細胞為終末分化的體細胞。