[發明專利]改善的真菌選擇

有效

• 申請號: 201380028411.5
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN104395454B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: C·L·奧爾森
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N15/81
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

本發明涉及構建重組真菌宿主細胞的方法，該重組真菌宿主細胞包括一個或多個拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸構建體，所述方法包括：用包括編碼選擇性標記物的第一多核苷酸和編碼目標多肽的第二多核苷酸的整合型多核苷酸構建體對真菌宿主細胞進行轉化，其中第一多核苷酸、其5’非翻譯區和/或與其可操作地連接的核糖開關包括在其分支位點和其受體位點之間具有5個核苷酸或更少的剪接體內含子；以及適合的多核苷酸構建體，生成的真菌宿主細胞及制造方法。

對序列表的引用

本申請含有計算機可讀形式的序列表，在此將其并入作為參考。

發明領域

本發明涉及構建重組真菌宿主細胞的方法，該重組真菌宿主細胞包括一個或多個拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸構建體，所述方法包括：用包括編碼選擇性標記物的第一多核苷酸和編碼目標多肽的第二多核苷酸的整合型多核苷酸構建體對真菌宿主細胞進行轉化，其中第一多核苷酸、其5’非翻譯區和/或與其可操作地連接的核糖開關包括在其分支位點和其受體位點之間具有5個核苷酸或更少的剪接體內含子；以及適合的多核苷酸構建體，生成的真菌宿主細胞及制造方法。

背景技術

為了多肽的高產量工業制造，生物技術工業要求提供無抗生素抗性標記物的微生物菌株，其包括若干染色體整合的目標基因的拷貝。抗生素標記物基因傳統上已用作選擇攜帶多個拷貝的標記物基因和伴隨的編碼工業上關注的多肽的表達盒的菌株的手段。由于在拷貝數和最終的產物產率之間常有直接關聯，通過增加微生物制造菌株中的拷貝數對表達盒進行擴增是所需要的。在過去20年，使用抗生素選擇標記物的擴增方法已經廣泛用于許多宿主菌株，不考慮單個表達盒的表達水平，其已被證明是在相對短期內開發高產率制造菌株的非常有效的方式。

之前已在芽孢桿菌(Bacillus)中顯示，從殘缺的(crippled)低水平啟動子表達的編碼半乳糖差向異構酶的基因可以用作串聯擴增的產物基因拷貝的位點特異性基因組整合的選擇性標記物(WO 2001/90393；Novozmes A/S)。但是，對于真菌宿主細胞尚未描述有類似系統。

核糖開關是mRNA分子的一部分，其可以與靶標小分子直接結合而不涉及蛋白質。靶標小分子的結合將會影響mRNA的翻譯[Nudler E,Mironov AS(2004).The riboswitchcontrol of bacterial metabolism(細菌新陳代謝的核糖開關控制).Trends BiochemSci 29(1):11–7；Vitreschak AG,Rodionov DA,Mironov AA,Gelfand MS(2004).Riboswitches:the oldest mechanism for the regulation of gene expression？(核糖開關：基因表達調節的最古老機制？).Trends Genet 20(1):44–50；Tucker BJ,BreakerRR(2005).Riboswitches as versatile gene control elements(作為通用的基因控制元件的核糖開關).Curr Opin Struct Biol 15(3):342–8；Batey RT(2006).Structuresof regulatory elements in mRNAs.(mRNA中調節元件的結構)Curr Opin Struct Biol16(3):299–306]。

在絲狀真菌細胞米曲霉(Aspergillus oryzae)中，thiA和nmtA基因的表達受核糖開關調節，該核糖開關結合硫胺素焦磷酸(TPP)，并控制可變剪接(alternativesplicing)，以有條件地產生上游可讀框(ORF)，從而影響下游基因的表達。米曲霉thiA核糖開關含有核內的前mRNA內含子——剪接體內含子，其參與促進可變剪接。