[發明專利]改善的真菌選擇

有效

• 申請號: 201380028411.5
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN104395454B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: C·L·奧爾森
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N15/81
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

1.一種構建重組真菌宿主細胞的方法，所述重組真菌宿主細胞包括兩個或更多個拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸構建體，所述方法包括：

a)提供用整合型多核苷酸構建體轉化的真菌宿主細胞，所述構建體包括編碼選擇性標記物的第一多核苷酸和編碼目標多肽的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸的5’非翻譯區中的核糖開關包括從分支位點到受體位點的核苷酸選自ctaactgaatag、ctaactgatag、ctaacgatag、ctaacatag、ctaactag、和ctaacag的剪接體內含子；

b)在有益于表達所述選擇性標記物的條件下培養轉化的真菌宿主細胞；以及

c)分離包括兩個或更多個拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸構建體的重組真菌宿主細胞。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主細胞包括三個或更多個拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸構建體。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主細胞包括四個或更多個拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸構建體。

4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述真菌宿主細胞是絲狀真菌宿主細胞。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述真菌宿主細胞為枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管菌屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢霉屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、稻瘟菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新美鞭菌屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、白腐菌屬(Phlebia)、Piromyces、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細胞。

6.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述真菌宿主細胞是酵母宿主細胞。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述真菌宿主細胞為念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母屬(Yarrowia)細胞。

8.根據權利要求7所述的方法，其中所述真菌宿主細胞為乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)細胞。

9.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中步驟(a)中的所述真菌宿主細胞具有生長缺陷，并且所述整合型多核苷酸構建體在整合到所述宿主細胞的基因組中時彌補所述生長缺陷。