[發明專利]用于誘導和擴增源自外周血單個核細胞的自然殺傷細胞的方法

有效

• 申請號: 201380028253.3
• 申請日: 2013-05-07
• 公開（公告）號: CN104321425B
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 李景美;林善雅;余嘉誠
• 申請（專利權）人: 株式會社NKMAX
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N13/00;A61K35/17
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 黎艷;胡杰

本發明涉及一種誘導和擴增源自外周血單個核細胞的自然殺傷（NK）細胞的方法，其中該方法包括：在存在細胞因子的條件下，將作為飼養細胞的經輻射的Jurkat細胞和經輻射的由EB病毒轉化的連續性淋巴細胞株（EBV?LCL）細胞與外周血單個核細胞進行共培養。根據本發明，可以從少量的外周血單個核細胞中誘導及增殖大量的NK細胞，而無需使用昂貴的設備或各種昂貴的細胞因子，從而可顯著提高將所述NK細胞用于癌癥時的預防和治療的效率和效能。

技術領域

本發明涉及一種用于誘導和擴增源自外周血單個核細胞的自然殺傷細胞的方法。

背景技術

免疫反應能從病原體中保護人體，且免疫系統由眾多免疫相關細胞和細胞因子組成。白細胞，尤其淋巴細胞在免疫系統中起重要作用。組成淋巴細胞的代表性細胞包括先天免疫系統細胞和后天免疫系統細胞。自然殺傷細胞（NK細胞）是一種具代表性的先天免疫細胞，已知自然殺傷細胞能以非特異性方式殺傷癌，識別并殺傷病毒、細菌等，而且可以用酶如穿孔素和顆粒酶殺傷病原體，或通過Fas-FasL相互作用殺傷病原體。據報告稱，對于癌癥患者而言，NK細胞的殺傷癌細胞的能力的降低與肺癌（Carrega P, et al., Cancer,2008: 112: 863-875）、肝癌（Jinushi M, et al., J Hepatol., 2005: 43; 1013-1020）、乳癌（Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 2003: 33: 119-124）、子宮癌（Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 1999: 79: 244-250）、血癌（Tajima F., etal, Lekemia 1996: 10: 478-482）等疾病的發病緊密相連。因此，為了癌癥治療，必須要提高癌癥患者的自然殺傷細胞的有關殺傷癌細胞的能力及活性。目前，嘗試著利用如NK細胞的損傷癌細胞的能力來治療實體癌（solid cancer）或血癌。

為了獲得殺傷癌細胞的效果，而需要大量的NK細胞，但難以保證從癌癥患者中能夠獲得大量血液，且血液中的NK細胞的量所占的比例也僅僅約5～20%。由于難以使用NK細胞作為免疫治療劑，從而重點在于能夠有效地擴張并增殖NK細胞。常用于擴增NK細胞的現有方法包括，利用如磁激活細胞分選（magnetic activated cell sorter，MACS）、cliniMACS或熒光激活細胞分選（fluorescence activated cell sorter，FACS）等裝置從骨髓或血液的單個核細胞中分離或誘導出NK細胞。在這種方法中，進行如下操作：1）在早期，從單個核細胞中分離NK細胞，并利用細胞因子對NK細胞進行擴增培養；2）去除與單個核細胞共存的T細胞，并利用細胞因子對NK細胞進行擴增培養；及3）在骨髓中存在的干細胞中誘導NK細胞。此外，根據已有的報告，通過利用飼養細胞從外周血單個核細胞（PBMCs）中分離NK細胞的方法包括，意大利Torelli研究小組的利用源自B細胞白血病的RPMI8866細胞株的方法和日本Ishikawa研究小組的利用源自腎母瘤細胞（Wilms tumor cell）的HFWT細胞株的方法。

然而，由于需要精良的設備來選擇細胞進行預擴增，并使用基因工程飼養細胞和昂貴的高濃度的各種細胞因子，從而使本領域中有報道的NK細胞的擴增方法受到了阻礙，進而普遍使用來可能過于昂貴，更加難以向病患群體實施該方法，其可用性受到了限制。

發明內容

技術問題

本發明涉及提供一種新型的用于誘導和擴增源自外周血的NK細胞的方法，從而引導出有效的策略，來獲得活化的源自外周血的NK細胞，而無需使用昂貴的設備、資源或不受監管所約束。

技術方案

為了解決這些問題，本發明的一方面提供一種有選擇地誘導和擴增源自外周血單個核細胞的NK細胞的方法，該方法包括以下的簡化方法：在存在細胞因子的條件下，將作為飼養細胞的經輻射的Jurkat細胞和經輻射的EBV-LCL細胞與外周血單個核細胞會以限定的比例及濃度進行共培養。