[發明專利]組合物和綴合寡核苷酸的方法

在審

• 申請號: 201380026149.0
• 申請日: 2013-04-29
• 公開（公告）號: CN104321332A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: K·W·希爾;V·R·默克勒
• 申請（專利權）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號: C07H19/00
• 分類號: C07H19/00;C07H19/052;C07H19/167;C07H21/00
• 代理公司: 北京市嘉元知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11484
• 代理人: 陳靜

優先權要求和相關的專利申請

本申請要求2012年5月21日提交的美國臨時申請序號61/649,766的優先權的利益，其全部內容整體引入本申請中作為參考。

發明領域

本申請概括而言涉及寡核苷酸的試劑、合成和純化領域。更具體地，本發明涉及寡核苷酸衍生物的組合物和綴合寡核苷酸的方法。

發明背景

可獲得許多用于使寡核苷酸與其它分子綴合的方法。這些方法典型地包括在靶向實體上連接反應性部分以與寡核苷酸偶聯。靶向實體與反應性部分通常分開制備，通常通過有機合成法制備，并在使用前純化。

在各種情況下將寡核苷酸用合適的官能團修飾用于與靶向實體上的反應性部分反應。寡核苷酸的修飾通常通過制備特定的亞磷酰胺和/或修飾堿基、和將它們于期望的位點引入到寡核苷酸序列中來完成。這些酰亞胺試劑中許多試劑含有需要保護基團的用于將這些試劑與寡核苷酸偶聯的官能團。這些保護基團必須在隨后的綴合反應發生之前脫除。作為替代，靶向實體上的反應性部分可在與寡核苷酸綴合之前產生。

目前大部分偶聯化學包括使用或產生綴合伴侶中至少一個的水解和/或氧化不穩定的物質(species)。在需要與寡核苷酸(或蛋白質、或任何有機不溶性/水溶性物質)綴合的條件下(典型地在含水溶液中)這是問題。

較新的綴合化學在反應時可能產生新穎結構。例如，授權給Pieken等的美國專利6,737,236，公開了用于生物分子綴合的環化加成反應。例如，在炔和疊氮化物之間的1,3-偶極環加成綴合(以后描述為點擊化學(click?chemistry)，Sharpless等Angew.Chem.Int.Ed.40:2004(2001))產生作為綴合產物部分的取代三嗪。如果寡核苷酸綴合物應用于人，則這些新化學實體可能是問題，因為這些新化學實體可能產生與寡核苷酸產品無關的毒性。

發明概述

本發明的一方面涉及具有式(A)結構的寡核苷酸衍生物：

其中R³為第一寡核苷酸；R¹選自烷基、環烷基、芳基、雜環基、雜芳基、聚乙二醇、肽、蛋白質、多糖、和第二寡核苷酸；R²為接頭或直連鍵；Z¹為NR⁴、S、或O，且Z²為NR⁴或S，其中R⁴選自H、烷基、芳基、雜環基、或雜芳基。

在本發明的一些實施方案中，R²為與第一寡核苷酸的核堿基上的5’羥基、3’羥基、或環外氨基連接的(C₁-C₁₂)接頭。在本發明的一些實施方案中，Z²為NH。在本發明的一些實施方案中，R¹為(C₁-C₁₂)烷基且Z¹為O。

在本發明的一些實施方案中，R¹為1K-40K聚乙二醇且Z¹為NH。在本發明的一些實施方案中，R¹為第二寡核苷酸且Z¹為NH，其中第二寡核苷酸可與第一寡核苷酸互補。

本發明的另一方面涉及綴合寡核苷酸的方法。根據本發明的一個實施方案的方法包括：合成包含氨基或硫醇基的寡核苷酸衍生物；和使3,4-二烷氧基環丁烯-1,2-二酮與寡核苷酸衍生物反應產生寡核苷酸-方形酸酯單-綴合物。

在本發明的一些實施方案中，方法還包括使寡核苷酸-方形酸酯單-綴合物與靶向實體反應，其中靶向實體選自聚乙二醇、肽、蛋白質、多糖、或第二寡核苷酸。

在本發明的一些實施方案中，寡核苷酸在寡核苷酸衍生物中的第二位置上包含第二氨基或硫醇基團，該方法還包括形成產生環狀結構的寡核苷酸內交聯。

本發明的其它方面和優點根據以下的說明書和所附權利要求書將是顯而易見的。

附圖簡述

圖1顯示方形酸和與方形酸的各種反應。

圖2顯示根據本發明的一個實施方案修飾的寡核苷酸和方形酸二酯之間的反應。

圖3顯示根據本發明的一個實施方案寡核苷酸-方形酸酯單加成物與靶向實體(例如，R-NH₂)的綴合。

圖4顯示根據本發明的實施方案寡核苷酸-方形酸酯單加成物與靶向實體的綴合。